[发明专利]一种快速对五种疟原虫检测并分型的方法

说明书

本发明公开了一套快速对五种疟原虫检测并分型的引物探针，其特征在于：包括：根据恶性疟原虫pf、间日疟原虫pv、卵形疟原虫po、三日疟原虫pm、诺氏疟原虫pk的18S基因保守片段设计的一对用于检测五种疟原虫的通用引物和探针分别为NF、NR、NP，两对用于区分五种疟原虫的共用引物分别为AF、AR、BF、BR，以及五条用于区分五种疟原虫的水解探针分别为pf‑P、pv‑P、po‑P、pm‑P、pk‑P，上述任一靶基因扩增的核苷酸序列长度在130bp以内；相比较扩增片段超过200bp的产品，本发明以减少扩增片段的方式减少延伸时间，能够在64分钟左右的时间内对对疑似疟疾患者做出精准、快速的临床辅助诊断，并对阳性患者做出5种疟原虫分型判断。

技术领域：

本发明属于分子生物学检测技术领域，特别涉及一种快速对五种疟原虫检测并分型的方法。

背景技术：

长期以来，人们认为只有四种疟原虫能感染人类，即恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫，而WHO疟疾专家有所提示：诺氏疟原虫早已开始在人类中传播，人类很有可能要面临第五种疟原虫感染的威胁。我国疟疾感染多发生在华中和华南地区，主要以恶性疟原虫和间日疟原虫的感染为主，疟疾是一种严重危害人类健康的疾病，因此疟疾的实验室检测技术有着至关重要的作用。

目前疟原虫常见的检测方法有镜检法、免疫层析技术、PCR 扩增法、环介导等温扩增等。镜检是检测疟原虫的金标准，但镜检需要显微镜进行检查，而且对人员要求、涂片及染色要求、镜检过程等，都需要较强的专业性；免疫层析法等免疫学检测疟原虫乳酸脱氢酶，操作简单，对人员要求较低，也完善了镜检重复性低的缺陷，但其检测准确度却远远不及核酸检测，对于部分虫数较低的样本，核酸检测技术以极高的准确性和灵敏度而有着重要的优势；核酸PCR扩增检测法拥有设计简单、产品性能稳定、检测通量多且不易出现假阳性等众多优点；目前市场上用于检测疟原虫的产品主要围绕恶性疟原虫、间日疟原虫、三日疟原虫、卵形疟原虫来设计的，往往忽略了诺氏疟原虫，而诺氏疟原虫的核苷酸序列跟间日疟原虫有着高度的相似性，因此在设计引物探针的时候不考虑诺氏疟原虫会很有可能导致间日疟原虫出现误检的风险；另一方面，根据部分专利及相关文献说明，市场上针对疟原虫核酸检测的常规产品，会设计扩增片段超过200bp以上的通用引物，而当扩增片段太长的时候引物需要更长的时间来延伸，因此在检测时间上会有一定程度的增加。

公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种快速对五种疟原虫检测并分型的方法，从而克服上述现有技术中的缺陷。

为实现上述目的，本发明提供了一套快速对五种疟原虫检测并分型的引物探针，包括：根据恶性疟原虫pf、间日疟原虫pv、卵形疟原虫po、三日疟原虫pm、诺氏疟原虫pk的18S基因保守片段设计的一对用于检测五种疟原虫的通用引物和探针分别为NF、NR、NP，两对用于区分五种疟原虫的共用引物分别为AF、AR、BF、BR，以及五条用于区分五种疟原虫的水解探针分别为pf-P、pv-P、po-P、pm-P、pk-P，上述任一靶基因扩增的核苷酸序列长度在130bp以内。

本发明为一种利用PCR扩增技术原理，在130bp的核苷酸序列内设计特异性引物探针。相比较扩增片段超过200bp的产品，本发明以减少扩增片段的方式减少延伸时间，能够在64分钟左右的时间内对对疑似疟疾患者做出精准、快速的临床辅助诊断，并对阳性患者做出5种疟原虫分型判断。

优选地，上述技术方案中，所述NF、NR、NP、AF、AR、pf-P、pv-P按照一定的反应浓度组合成A组反应液，将BF、BR、po-P、pm-P、pk-P按照一定的反应浓度组合成B组反应液。