[发明专利]一种快速对五种疟原虫检测并分型的方法

权利要求书

1.一套快速对五种疟原虫检测并分型的引物探针，其特征在于：包括：根据恶性疟原虫pf、间日疟原虫pv、卵形疟原虫po、三日疟原虫pm、诺氏疟原虫pk的18S基因保守片段设计的一对用于检测五种疟原虫的通用引物和探针分别为NF、NR、NP，两对用于区分五种疟原虫的共用引物分别为AF、AR、BF、BR，以及五条用于区分五种疟原虫的水解探针分别为pf-P、pv-P、po-P、pm-P、pk-P，上述任一靶基因扩增的核苷酸序列长度在130bp以内。

2.根据权利要求1所述的快速对五种疟原虫检测并分型的引物探针，其特征在于：所述NF、NR、NP、AF、AR、pf-P、pv-P按照一定的反应浓度组合成A组反应液，将BF、BR、po-P、pm-P、pk-P按照一定的反应浓度组合成B组反应液。

3.根据权利要求2所述的快速对五种疟原虫检测并分型的引物探针，其特征在于：还包括根据人源核糖核苷酸酶P基因设计的一对内参基因引物和探针分别为EF、ER、EP，所述NF、NR、NP、AF、AR、pf-P、pv-P、EF、ER、EP按照一定的反应浓度组合成A组反应液，将BF、BR、po-P、pm-P、pk-P、EF、ER、EP按照一定的反应浓度组合成B组反应液。

4.根据权利要求1所述的快速对五种疟原虫检测并分型的引物探针，其特征在于：用于检测五种疟原虫的通用引物和探针NF、NR、NP具体为：

通用引物NF：5’-GAGGAATGCCTAGTAAGCATGATT-3’，

通用引物NR：5’-TCCAAACAATTCATCATATCTTTCA-3’，

通用探针NP：5’-CY5-TGACTACGTCCCTGCCCTTTGTACAC-BHQ3-3’。

5.根据权利要求1所述的快速对五种疟原虫检测并分型的引物探针，其特征在于：扩增恶性疟原虫、间日疟原虫的共用引物和特异性探针：

共用引物AF：5’-GTGCTACACTGATATRTATAACGAGTTWTT-3’，

共用引物AR：5’-AGATTACCTACRCYTTTCRGYGG-3’，

间日疟原虫探针pv-P：5’-VIC- ATTCAGCTTGCTGTTTCGTATTT-MGB-3’，

恶性疟原虫探针pf-P：5’-FAM-TTTGCATACTTTTCCTCCGCCGA-BHQ1-3’。

6.根据权利要求1所述的快速对五种疟原虫检测并分型的引物探针，其特征在于：扩增三日疟原虫、卵形疟原虫、诺氏疟原虫的共用引物和特异性探针，序列如下：

共用引物BF：5’-CACGCGTGCTACACTGATATG-3’，

共用引物BR：5’-ACGATATGTAYTGATAAAGATTACCTACAC-3’，

卵形疟原虫探针po-P：5’-VIC-CTCTTTCAAATTGTATAGTTTTCCTC-MGB-3’，

三日疟原虫探针pm-P：5’-CY5-TGCAAAGAATATATAGTTTTCCTCCA-MGB-3’，

诺氏疟原虫探针pk-P：5’-FAM-CGATTTTAGCTGCTTGCAGTTTA-BHQ1-3’。

7.根据权利要求1所述的快速对五种疟原虫检测并分型的引物探针，其特征在于：扩增内参基因的引物和探针序列如下：

内参基因引物EF：5’-AGATTTGGACCTGCGAGCG-3’，

内参基因引物ER：5’-GAGCGGCTGTCTCCACAAGT-3’，

内参基因探针EP：5’-ROX-TTCTGACCTGAAGGCTCTGCGCG-BHQ2-3’。

8.一种快速对五种疟原虫检测并分型的检测试剂盒，其特征在于：包括如权利要求1-7任一权利要求的引物探针组合物。

9.一种快速对五种疟原虫检测并分型的方法，具体按照如下步骤进行：

步骤1，模板DNA提取：使用细菌DNA提取试剂盒提取待检样本中的DNA；

步骤2，实时荧光PCR扩增反应：在100µl或200µl PCR管分别配制A组、B组反应体系：A组、B组引物探针混合液7.5µl，Taqman OneStep Buffer 7.5µl，酶混合液5µl，模板DNA 5µl，将上述反应管于实时荧光PCR仪，设置下列程序进行PCR扩增：

步骤2.1，95℃×5min，1cycles；

步骤2.2，95℃×10sec，55℃×30sec，40cycles；

在步骤55℃，30s时对FAM、VIC、ROX、CY5通道的荧光信号进行采集；

步骤3，结果判读：

步骤3.1，阳性判断值：

通过检测临界阳性样本和阴性样本，采用统计学方法绘制ROC曲线，采用约登指数Youden index确定阳性判断值；

阳性：检测结果Ct≤38且曲线呈典型S且具有明显的指数增长期；

阴性：Ct＞40或者未检出；

疑似：38＜Ct≤40，疑似样本需要重新复检，Ct值仍在此区间内，且曲线呈典型S且具有明显的指数增长期时，可判读为阳性，否则判读为阴性；

步骤3.2，对结果进行判读：当A组CY5通道结果为阳性时，可判读该样本检测结果为阳性；当判读为疟原虫阳性时，可参考A组FAM、VIC和B组FAM、VIC、CY5通道判读结果对该阳性疟原虫进行分型；当A组、B组ROX通道信号为阳性，且两管其他通道均为阴性时，可判读该样本检测结果为阴性；当A组CY5通道结果为阴性时，且A组、B组ROX通道信号为阴性时，可判读为该样本检测结果不合格，需要重新采样并检测。