[发明专利]一种眼球前房注射MNU诱导动物角膜内皮病变的方法

权利要求书

1.一种眼球前房注射MNU诱导动物角膜内皮病变的方法，其特征在于：诱导方法步骤如下：

a.在SPF条件下饲养成年新西兰兔；

b.待步骤a完成后，将MNU溶解在30％二甲基亚砜(DMSO)和70％磷酸盐缓冲盐水(PBS)的混合液中，接着分别以MNU2.0、2.5、3.0mg/kg BW的剂量进行兔眼前房内注射(n＝8)，然后通过角膜缘将150μl MNU溶液或溶剂(DMSO和PBS混合液)注入前房；

c.待步骤b完成后，再对眼压和眼前节进行检查，分别在MNU建模后P1，P3，P7，P14和P28天对兔进行双眼眼压，裂隙灯拍照及眼前节光学相干断层扫描(AS-OCT)检查，以监测眼压和角膜水肿程度和角膜厚度，接着应用TONO-PEN AVIA压平眼压笔给兔眼进行眼压测量，每眼10次测量在15秒内完成，LCD感应器将自动显示眼压数值及统计可信区间，再用裂隙灯观察MNU诱导角膜内皮失代偿模型的兔角膜水肿及眼前节受累情况，最后用眼前节光学相干断层扫描(AS-OCT)测量中央角膜厚度(CCT)；

d.待步骤c完成后，再分别在P1，P3，P7，P14，P28进行IVCM检查，应用“Section”模式逐层扫描角膜全层，观察角膜各层细胞的数量和形态；

e.待步骤d完成后，再对角膜的组织学进行分析，分别在P1，P3，P7，P14，P28通过耳缘静脉注射过量戊巴比妥钠处死兔子，接着分离出角膜，然后将角膜自中心呈放射状切开分成4份，最后分别用于角膜铺片染色、病理切片、冰冻切片及透射电镜检查；

f.待步骤e完成后，再使用TUNEL法检测角膜切片细胞凋亡，先将4％多聚甲醛固定30-60分钟,PBS洗涤2次，每次10分钟，接着加入0.5％Triton X-100的PBS，室温孵育5分钟，用PBS洗涤2次，然后配置TUNEL检测液，在样品上加50μl TUNEL检测液，使TUNEL检测液均匀覆盖待测样品表面，避光湿盒37℃孵育60分钟，PBS洗涤3次，最后用DAPI封片后共聚焦显微镜下观察；

g.待步骤f完成后，最后1/4角膜进行SEM观察，以确认角膜内皮的变化，首先用2.5％戊二醛磷酸缓冲液前固定和1％锇酸后固定，接着用酒精梯度脱水，然后用乙酸异戊酯置换，最后再将角膜进行临界点干燥、喷金后用扫描电镜观察摄片；

h.待步骤g完成后，最后用GraphPadPrism7软件对数据进行统计学分析，用均数±标准误表示计量数据，各组之间比较应用单因素的方差分析或双因素方差分析，Duncan'spost-hoc检验用来比较单因素方差分析的各组间差异，Tukey’s multiple comparisons检验用来比较多因素方差分析的各组间差异，P＜0.05被认为具有统计学意义。

2.根据权利要求1所述的一种眼球前房注射MNU诱导动物角膜内皮病变的方法，其特征在于：所述步骤a中新西兰兔体重为2.0-2.5kg，12个月大，雄性，从北京金牧阳实验动物养殖有限公司购买，在适应1周后，将这些兔子用于实验。

3.根据权利要求1所述的一种眼球前房注射MNU诱导动物角膜内皮病变的方法，其特征在于：所述步骤b中分别以MNU2.0、2.5、3.0mg/kg BW的剂量进行兔眼前房内注射，注射过程中使用30G一次性无菌注射器针头，通过角膜缘将150μl MNU溶液或溶剂(DMSO和PBS混合液)注入前房，注药前先缓慢吸出等体积的房水。

4.根据权利要求1所述的一种眼球前房注射MNU诱导动物角膜内皮病变的方法，其特征在于：所述步骤c中TONO-PEN AVIA压平眼压笔是根据Mackay–Marg原理进行测量的，结果准确且受角膜厚度的影响较小，所述CCT测量共进行三次，并对每只眼睛取平均值。

5.根据权利要求1所述的一种眼球前房注射MNU诱导动物角膜内皮病变的方法，其特征在于：所述步骤d中IVCM检查采用的是海德堡视网膜激光断层扫描系统III代，激光波长为670nm，分辨率1μm,放大倍率为800倍，图像面积为400μm×400μm。