[发明专利]一种香蒲重金属ATP酶基因TyHMA3的克隆与功能表达方法

说明书

本发明属于生物技术综合利用领域，公开了一种香蒲重金属ATP酶基因TyHMA3的克隆与功能表达方法，一种香蒲重金属ATP酶基因TyHMA3，为序列表中的SEQID NO.1所示的核苷酸序列。为序列表中的SEQID NO.2所示的氨基酸序列。一种能扩增出SEQID NO.1的PCR引物组。所述引物组为：HMA‑F（TCTCAGTCTACTATTTAG）；HMA‑R（TCAATCATAAAGAAGAAA）。一种用于香蒲重金属ATP酶基因TyHMA3克隆的载体，所述载体为pMD19‑T载体。本发明提供的基因TyHMA3在香蒲根中表达量最高，具有组织特异性，并受Cd²⁺和Pb²⁺诱导，迅速强烈表达。表明该基因参与调控香蒲对重金属的耐受性。对香蒲重金属强耐受性机理提供理论基础，为植物重金属耐受性的利用提供促进作用。

技术领域

本发明涉及生物技术综合利用领域，具体的说是一种香蒲重金属 ATP 酶基因TyHMA3 的克隆与功能表达方法。

背景技术

随着工农业发展，土壤重金属污染程度日益严重，其中较为突出的重金属有镉（Cd）和铅（Pb）。高浓度的 Cd²⁺和 Pb²⁺被植物吸收之后会引起细胞膜降解、离子外渗以及酶活性丧失，并可干扰植物体水分吸收、离子转运、细胞代谢等正常生理生化过程，对植物造成极大的伤害，甚至会导致枯萎死亡。

P-type ATPase（P-ATPase）是一类通过水解 ATP 跨膜运送金属阳离子的转运蛋白构成的超级家族，该家族成员可选择性地吸收、转运部分必需金属离子（Zn²⁺、Cu²⁺和 Co²⁺）及重金属离子（Cd²⁺和 Pb²⁺）。Heavy Metal ATPase（HMA）隶属于P-ATPase，多数定位在细胞质膜与液泡膜上，是介导重金属离子吸收、转运与区隔过程的关键转运蛋白，在植物重金属离子吸收、木质部装载、液泡区隔与离子稳态过程中发挥重要作用。

目前，HMA的相关研究仅局限在拟南芥、大田作物和少部分重金属超累积物种上。HMA类蛋白对转运金属离子具有明显的转移性，一般可分为两大亚组。其中，Zn/Cd/Co/Pb亚组含有三个特有结构域，即1个N端的 Heavy-metal-associated（HMA）结构域，一个E1-E2_ATPase结构域以及一个Hydrolase结构域，此外还包含HMA特有的DKTGT、CPC、GICC、GDG、TGEx等基序。

香蒲（Typha angustifolia），也称蒲草、水蜡烛，多年水生宿根草本植物，在我国分布广泛。香蒲常生于池塘、河滩等潮湿多水处，既是水生观赏植物，也是历史悠久的水生蔬菜，称为蒲菜。香蒲具有生长迅速、生物量大、适应性和重金属耐受性强等特点，目前人们对香蒲的研究主要集中在其对水体净化作用上。而对香蒲优良的重金属耐性及地下部富集重金属的特性却缺乏相应的功能表达方法研究。为此，我们提出了一种香蒲重金属ATP酶基因TyHMA3的克隆与功能表达方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种香蒲重金属ATP 酶基因 TyHMA3 的克隆与表达分析，本研究以淮安本地香蒲品种“淮蒲 1 号”为实验材料，克隆获得 TyHMA3 基因并利用生物信息学手段初步分析该基因，同时利用实时荧光定量分析香蒲不同组织及 Cd²⁺和 Pb²⁺重金属离子胁迫下的表达模式，研究其在香蒲耐重金属机制中的作用；本研究将为植物抗重金属胁迫机理提供理论依据，并为抗重金属胁迫育种提供新的基因资源，可以有效解决背景技术中提出的问题。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为，