[发明专利]一种香蒲重金属ATP酶基因TyHMA3的克隆与功能表达方法

权利要求书

1.一种香蒲重金属 ATP 酶基因 TyHMA3，其特征在于，为序列表中的SEQID NO.1所示的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述一种香蒲重金属 ATP 酶基因 TyHMA3，其特征在于，为序列表中的SEQID NO.2所示的氨基酸序列。

3.一种能扩增出SEQID NO.1的多重PCR引物组。

4.根据权利要求3所述的引物组，其特征在于，所述引物组为：

HMA-F（TCTCAGTCTACTATTTAG）；

HMA-R（TCAATCATAAAGAAGAAA）。

5.一种用于权利要求1所述的香蒲重金属 ATP 酶基因 TyHMA3克隆的载体，其特征在于，所述载体为pMD19-T 载体。

6.一种香蒲重金属 ATP 酶基因 TyHMA3克隆方法，其特征在于，包括以下步骤，

S1.选取香蒲幼苗作为供试材料；

S2.将S1中的香蒲幼苗放入营养液中培养，待叶片生长到 25-40cm时，选择正常健壮且长势一致的植株，剪取根、走茎、假茎、叶片组织样品；

S3.提取S2中各个样品的总mRNA，并将各样品的总mRNA等比例混合；

S4.将S3提取出的总mRNA构建香蒲 cDNA 文库；

S5.香蒲组织三代转录组测序数据及注释结果，检索并拼接香蒲 HMA 基因；

S6.将S4中的cDNA与S5中拼接香蒲 HMA 基因设计权利要求4所述的引物组；

S7.用S6设计的引物组、以S4中的cDNA为模板进行PCR反应，分离和回收；

S8. 将S7回收产物连入权利要求5所述载体并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞培养，挑选阳性单克隆进行测序分析。

7.根据权利要求6所述的一种香蒲重金属 ATP 酶基因 TyHMA3克隆方法，其特征在于，所述PCR反应程序为：94 ℃预变性4 min; 94 ℃变性30 s, 50 ℃退火30 s, 72℃延伸3min，35循环; 72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。

8.一种如权利要求1所述的香蒲重金属ATP酶基因TyHMA3功能表达方法，其特征在于，包括以下步骤：

D1. 材料处理及取样：

（1）CK，正常 Hoagland 营养液；

（2）T1，0.1 mmol/L Pb(NO₃)₂ 处理；

（3）T2，0.25 mmol/L Pb(NO₃)₂ 处理；

（4）T3，0.05 mmol/L CdCl₂处理；

（5）T4，0.15 mmol/LCdCl₂ 处理；

且分别于 0、2、6、12、24、48 h 和 96h 剪取根和叶片组织，三次重复，每次取鲜样 0.2g，液氮速冻 1 h 后放入-80 ℃冰箱保存备用；

D2. 分别提取D1香蒲不同组织及处理的总RNA, 反转录成cDNA，利用实时荧光定量PCR检测TyHMA3基因相对表达量。

9.根据权利要求8所述的一种香蒲重金属ATP酶基因TyHMA3功能表达方法，其特征在于，所述荧光定量PCR反应程序为：94℃ 30 s；94 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40个循环。

10.根据权利要求8所述的一种香蒲重金属ATP酶基因TyHMA3功能表达方法，其特征在于，所述TyHMA3基因荧光定量引物为qHMA3-F（TGGT TATATCAGTGTAAGAA）和qHMA3-R（CAGGAATCTATCAATCTCT）。