[发明专利]一种呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的鉴定引物、探针、试剂盒及方法

说明书

本发明公开了一种呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的鉴定引物、探针、试剂盒，并提供了一种基于该引物及探针的鉴别呼伦贝尔短尾羊纯合子和杂合子的方法。所述方法包括如下步骤：(1)提取呼伦贝尔短尾羊血液基因组DNA并稀释；(2) 对步骤(1)获得的DNA进行taqman SNP荧光探针qPCR；（3）产物检测。通过taqman SNP荧光探针qPCR，能够快速分辨出呼伦贝尔短尾羊纯合子与杂合子。本发明作为呼伦贝尔短尾羊基因分型的手段之一，鉴定方法操作简便，重复性好，反应时间短，具有极高的灵敏性和特异性。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种基于taqman SNP荧光探针的呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的鉴定引物、探针、试剂盒及方法。

背景技术

呼伦贝尔短尾羊是生长在我国呼伦贝尔地区的肉用绵羊品种之一，短而肥厚的尾部是该品系独特的标志。我们利用基因组重测序技术筛选到与脊椎发育相关的T/Brachyury基因作为候选基因，并确定在呼伦贝尔短尾羊群体中存在稳定T/Brachyury基因c.G334T突变，并证明“短尾”这一具有经济价值的性状相关。在绵羊分子育种中，纯合子个体相对于杂合子后代性状表现稳定，因而近年来，人们更倾向于筛选种群中纯合个体作为主要的繁育对象。

传统测序主要以sanger测序法为基础，与具有商业价值相关性状的SNP位点关联作为依据，Sanger法是根据核苷酸在某一固定的点开始，随机在某一个特定的碱基处终止，并且在每个碱基后面进行荧光标记，产生以A、T、C、G结束的四组不同长度的一系列核苷酸，然后在尿素变性的PAGE胶上电泳进行检测，从而获得可见DNA碱基序列的一种方法。

传统测序技术存在着用时长、成本高、通量低、DNA模板的组成或二级结构有时引起DNA聚合酶不正常终止的缺点。

发明内容

本发明目的在于提供一种呼伦贝尔短尾羊的鉴定引物、探针、试剂盒及方法，克服传统sanger测序法由于技术限制的原因，一次鉴定的样品数量较少，操作较为繁琐，用时长。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

一种呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的鉴定引物及探针，其特征在于，序列如下：

正向引物：5’-TGCGCCCCTTCCTTTTCAG-3’

反向引物：5’- GGGGGAGTCGGGGTGGATGTAG-3’

taqman探针1：5’HEX- TGGCTTGCCCCCCGGCA-BHQ1 3

taqman探针2：5’FAM- GCTTGCCCCAGGGCACCCA-BHQ1 3，

所述taqman探针1和2为荧光标记探针；

一种鉴定呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的试剂盒，包括上述鉴定引物及探针，还包括如下成分：PCR反应混合液，呼伦贝尔短尾羊基因组DNA，呼伦贝尔短尾羊T/Brachyury基因纯合子、杂合子所制备的标准品质粒。

优选地，所述PCR反应混合液包括SNP Probe Master Mix（2X）10 ul及RNase-FreeddH₂O 4.6 ul。

优选地，所述呼伦贝尔短尾羊基因组DNA的浓度为10 ng/ ul，用量为1 ul。

一种鉴定呼伦贝尔短尾羊纯合子和杂合子的方法，包括如下步骤：

(a) 提取呼伦贝尔短尾羊血液基因组DNA并稀释；

(b) 荧光定量PCR反应体系扩增呼伦贝尔短尾羊Brachyury/T基因的片段序列，序列片段为纯合、杂合短尾羊Brachyury/T基因的95879486位点至95879323位点，如SEQ IDNO：5的DNA序列所示，所述PCR反应体系包括上述鉴定引物及探针；

(c) PCR反应产物检测。