[发明专利]一种呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的鉴定引物、探针、试剂盒及方法在审
| 申请号： | 202110056027.2 | 申请日： | 2021-01-15 |
| 公开（公告）号： | CN112553349A | 公开（公告）日： | 2021-03-26 |
| 发明（设计）人： | 曹贵方;杨光;宋永利;窦傲蕾;马腾;智达夫;苏红;刘默凝;杨宏新;霍雨佳;李喜和;何亭漪;杨燕燕;达来;李秀男 | 申请（专利权）人： | 内蒙古农业大学 |
| 主分类号： | C12Q1/6888 | 分类号： | C12Q1/6888;C12Q1/6858;C12N15/11 |
| 代理公司： | 天津市杰盈专利代理有限公司 12207 | 代理人： | 赵敬 |
| 地址： | 010018 内蒙古自*** | 国省代码： | 内蒙古;15 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 呼伦贝尔 短尾 纯合子 合子 鉴定 引物 探针 试剂盒 方法 | ||
1.一种呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的鉴定引物及探针，其特征在于，序列如下：
正向引物：5’-TGCGCCCCTTCCTTTTCAG-3’
反向引物：5’- GGGGGAGTCGGGGTGGATGTAG-3’
taqman探针1：5’HEX- TGGCTTGCCCCCCGGCA-BHQ1 3
taqman探针2：5’FAM- GCTTGCCCCAGGGCACCCA-BHQ1 3；
所述taqman探针1和2为荧光标记探针。
2.一种鉴定呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的试剂盒，包括权利要求1所述的鉴定引物及探针，其特征在于，还包括如下成分：PCR反应混合液，呼伦贝尔短尾羊基因组DNA，呼伦贝尔短尾羊T/Brachyury基因纯合子、杂合子所制备的标准品质粒。
3.根据权利要求2所述的一种鉴定呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应混合液包括SNP Probe Master Mix（2X） 10 ul及RNase-Free ddH2O 4.6ul。
4.根据权利要求2所述的一种鉴定呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的试剂盒，其特征在于，所述呼伦贝尔短尾羊基因组DNA的浓度为10 ng/ul，用量为1 ul。
5.一种鉴定呼伦贝尔短尾羊纯合子和杂合子的方法，包括如下步骤，其特征在于，所述PCR反应体系包括权利要求1所述的鉴定引物及探针：
(a) 提取呼伦贝尔短尾羊血液基因组DNA并稀释；
(b) 荧光定量PCR反应体系扩增呼伦贝尔短尾羊Brachyury/T基因的片段序列，序列片段为纯合、杂合短尾羊Brachyury/T基因的95879486位点至95879323位点，如SEQ ID NO：5的DNA序列所示；
(c) PCR反应产物检测。
6.根据权利要求5所述的鉴定呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的方法，其特征在于，所述步骤（b）中PCR反应体系总体积为20ul，包括SNP Probe Master Mix (2X) 10 ul，正向引物 1.8 ul，反向引物 1.8 ul，正向、反向引物浓度比例为1：10，10uM taqman探针1 0.4ul，10uM taqman探针2 0.4ul，10 ng/ul DNA模板1 ul，RNase-Free ddH2O 4.6 ul。
7.根据权利要求5所述的鉴定呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的方法，其特征在于，所述PCR反应按照如下反应程序进行：95 ℃预变性：30 s，95 ℃变性：10 s，60 ℃退火-延伸：30 s，扩增45个循环，PCR反应结束后在荧光读板仪上进行荧光扫描拍照60 ℃，30 s。
8.根据权利要求6所述的鉴定呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的方法，其特征在于，所述正向引物的浓度为1 uM，反向引物的浓度为10 uM。
9.根据权利要求6所述的鉴定呼伦贝尔短尾羊纯合子、杂合子的方法，其特征在于，所述SNP Probe Master Mix含有内参荧光染料。
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