[发明专利]一种从双子叶植物根及下胚轴中分离维管束的方法

说明书

本发明公开了一种从双子叶植物根及下胚轴中分离维管束的方法，所述方法包括：植株培养、固定、维管束剥离、纤维素酶和果胶酶消化以及用Triton X‑100剔除杂质污染。本发明通过在固定步骤中利用茶皂素协助维管束与邻近组织分离，然后用纤维素酶和果胶酶进行联合消化处理，有效去除了维管及邻近组织中的细胞壁、胞间残留物、纤维组织及膜样物质残留等，进一步利用Triton X‑100洗脱维管束周围组织，有效剔除膜样软组织的粘连污染，从而将维管束从根及下胚轴中分离出来，采用该方法分离得到的维管束，在显微镜下可观察到清晰的形态结构，无杂质影响，该方法简单快速易实施，分离效果好，可用于维管束形成和发育的研究。

技术领域

本发明属于维管束分离技术领域，具体涉及一种从双子叶植物根及下胚轴中分离维管束的方法。

背景技术

维管束是维管植物的输导系统，在植物体内常呈束状结构，贯穿在植物体的各种器官内。主要分为韧皮部和木质部,韧皮部包括筛管和伴胞，主要负责同化物的运输；木质部以导管为主，负责输送水分和无机盐类。维管束除了具有运输作用外，还对植物器官起着机械支撑作用。

一直以来，对于维管束的形成和发育研究受到学界的广泛重视，现有技术中一般借助显微与超显微技术就植物某些部位的发生、发育和结构进行多维度探索，然而目前已知的可观察到高清晰维管束形态结构的显微技术一直没有出现，其主要原因是现有技术中缺乏维管束完全分离技术，进而限制了对维管束形态发育的深入研究。

发明内容

本发明的目的在于提供一种从双子叶植物根及下胚轴中分离维管束的方法，具体为：将植物的根及下胚轴浸泡润洗固定后，在显微镜下将维管束与相邻组织分开，并将解剖后的材料用纤维素酶和果胶酶进行联合消化处理，并进一步利用Triton X-100洗脱维管束周围的膜样软组织，从而实现维管束的分离，采用该方法分离得到的维管束，在显微镜下可观察到清晰的形态结构。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：

一种从双子叶植物根及下胚轴中分离维管束的方法，包括以下步骤：

P1：选取植物种子，经表面消毒后播种至培养基并培养；

P2：选取P1中生长健壮的完整植株，去除叶片，留取根和下胚轴，置于离心管中；

P3：向P2的离心管中加入含有体积分数0.1％茶皂素的PEM缓冲液，浸泡30-40分钟，然后用PEM缓冲液润洗，将润洗后的材料在含体积分数4％多聚甲醛的PBS缓冲液中固定30-40分钟，然后再次用PEM缓冲液冲洗；该步骤在PEM缓冲液中加有茶皂素，茶皂素能快速浸润到根及下胚轴组织，以降低维管束与邻近组织间的连接，因此便于维管束的剥离。

P4：在解剖显微镜下，用解剖针将维管束与其相邻组织分开，并将维管束取出，放入装有PEM缓冲液的离心管中；利用解剖针进行分离得到的解剖材料，其中不仅含有维管束，还含有维管束鞘细胞残留壁、纤维组织、膜样物质等多种细胞或胞间残留物，因此无法直接用于观察维管束的形态结构。

P5：取P4中解剖后的材料，放入含有纤维素酶和果胶酶的酶液中，于28℃消化处理；该步骤中利用纤维素酶和果胶酶进行联合消化处理，可有效去除解剖材料中的残留细胞壁、胞间残留物、纤维组织及部分膜样物质等。

P6：将P5中消化完全的材料放入Triton X-100中清洗15-20分钟，然后用PEM缓冲液冲洗，冲洗完毕后即完成对植物根及下胚轴中维管束的分离。该步骤中进一步采用Triton X-100对维管束进行清洗，以去除维管束周围的组织，有效剔除膜样软组织的粘连污染。

进一步的，在步骤P5中，所述酶液的组分包括：5mM MES缓冲液，0.5％(w/v)纤维素酶，0.2％(w/v)果胶酶，0.12M蔗糖和1mM CaCl₂，并调节pH为5.5。