[发明专利]一种从双子叶植物根及下胚轴中分离维管束的方法

权利要求书

1.一种从双子叶植物根及下胚轴中分离维管束的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

P1：选取植物种子，经表面消毒后播种至培养基并培养；

P2：选取P1中生长健壮的完整植株，去除叶片，留取根和下胚轴，置于离心管中；

P3：向P2的离心管中加入含有体积分数0.1％茶皂素的PEM缓冲液，浸泡30-40分钟，然后用PEM缓冲液润洗，将润洗后的材料在含体积分数4％多聚甲醛的PBS缓冲液中固定30-40分钟，然后再次用PEM缓冲液冲洗；

P4：在解剖显微镜下，用解剖针将维管束与其相邻组织分开，并将维管束取出，放入装有PEM缓冲液的离心管中；

P5：取P4中解剖后的材料，放入含有纤维素酶和果胶酶的酶液中，于28℃消化处理；

P6：将P5中消化完全的材料放入Triton X-100中清洗15-20分钟，然后用PEM缓冲液冲洗，冲洗完毕后即完成对植物根及下胚轴中维管束的分离。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤P5中，所述酶液的组分包括：5mMMES缓冲液，0.5％(w/v)纤维素酶，0.2％(w/v)果胶酶，0.12M蔗糖和1mM CaCl₂，并调节pH为5.5。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述PEM缓冲液包括：50mM PIPES、5mMEGTA、2.5mM MgSO₄，并调节pH为6.9。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤P1中，在通风橱内用氯气对植物种子进行表面消毒。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在步骤P1中，将表面消毒后的种子播种至MS培养基上，在16h光照/8h黑暗，22-23℃条件下培养7-30天。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤P3具体为：向P2的离心管中加入20mL含有体积分数0.1％茶皂素的PEM缓冲液，浸泡30-40分钟，然后用PEM缓冲液润洗3次，每次20分钟，将润洗后的材料在含体积分数4％多聚甲醛的PBS缓冲液中，于-20℃真空干燥条件下固定30-40分钟，然后再次用PEM缓冲液冲洗3次，每次5分钟。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，重复步骤P4，以获得多个解剖后的材料，且解剖后的材料数量不超过6个。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤P5的消化处理过程中，随时镜检，直至观察到维管束上残留的组织消化完全。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤P6中所述Triton X-100的浓度为5％。