[发明专利]一种能提高生产效率的无菌毛大肠杆菌的构建及应用

说明书

本发明公开了一种能提高生产效率的无菌毛大肠杆菌的构建及应用，属于基因工程和发酵工程领域。本发明敲除大肠杆菌基因组上菌毛基因簇的64个基因得到突变菌WQM026，该菌株在营养缺乏的培养基中生长变快，菌体总量增多。将PHB和L‑苏氨酸合成的相关基因分别转化到菌株WQM026中，得到的重组菌WQM026/pBHR68和WQM026/pFW01‑thrA*BC‑rhtC可以分别高效合成PHB和L‑苏氨酸。合成的PHB占细胞干重的87.87％，是野生型对照菌的3.44倍。L‑苏氨酸产量为2.49g/L，是野生型对照菌的3.66倍。

技术领域

本发明涉及一种能提高生产效率的无菌毛大肠杆菌的构建及应用，属于基因工程和发酵工程领域。

背景技术

细菌菌毛是出现在细胞上的大而长、薄的超分子蛋白质附属物，负责生物膜的形成、趋化、粘附和DNA跨膜转移。菌毛也是细菌生物膜的重要组成部分，对工业活动有多种不利影响，如增加产品变质或污染的风险、引起严重感染、形成休眠细胞以增加抗生素耐药性、消耗细菌的能量和底物，阻断营养物质扩散，形成生物污垢，减少传热，增加腐蚀，缩短发酵设备的使用寿命。

聚羟基烷酸盐(PHAs)是由多种羟基酰基辅酶a作为底物合成的，并作为不溶性球形包裹体或PHA颗粒保留在细胞内。一般认为，PHAs在降低碳当量和储存多余碳方面起着重要作用，这可以提高细胞在饥饿时的抗应力能力。PHAs具有生物降解性、生物相容性、气体阻隔性、压电性、非线性光学活性等由官能团引起的特殊性质。PHAs的性质决定了它可以用作生物降解塑料、组织工程支架和许多其他潜在的应用。聚3-羟基丁酸酯(PHB)是PHA中的一种，大肠杆菌常用于PHB的工业生产。L-苏氨酸是人体必需的营养氨基酸，是蛋白质合成的重要组成部分。广泛应用于人类食品、化妆品、医药、动物饲料和保健品。

大肠杆菌合成PHB和L-苏氨酸的关键在于平衡产物和细胞生长，既要使得细胞生长好，又要增强其合成途径的代谢流，并通过控制产物形成途径的表达水平来提高产量。现有报道中主要通过优化发酵条件、优化代谢途径、提高胞内辅酶浓度和优化表达质粒等手段来改善PHB的合成；L-苏氨酸的高效合成主要集中在代谢途径的修饰上，如脂肪酸阻断、磷酸转移酶系统、底物再分配等方面。而合成PHB和L-苏氨酸的底物乙酰辅酶A和草酰乙酸分别来自糖酵解途径和柠檬酸循环途径，若要高产PHB和L-苏氨酸会消耗大量的碳源，并严重影响菌体生长。这使得PHB产量的提高无法满足工业上生产的需求，L-苏氨酸发酵生长缓慢。因此，提供一种新的促进菌株生长并提高PHB和L-苏氨酸合成的方法，对于进一步提高PHB和L-苏氨酸的合成具有十分重大的意义。

发明内容

为了解决上述存在的技术问题，本发明在大肠杆菌中敲除大肠杆菌基因组上菌毛基因簇的64个基因得到突变菌WQM026，WQM026菌株在营养缺乏(M9)培养基中生长变快，菌体总量增多。随后将PHB和L-苏氨酸合成的相关基因分别转化到精简菌株WQM026中，得到的重组菌WQM026/pBHR68和WQM026/pFW01-thrA*BC-rhtC可以高效合成PHB和苏氨酸。

本发明的第一个目的提供一种促进大肠杆菌生长并提高发酵产品产量的方法，所述方法是敲除大肠杆菌基因组上菌毛基因簇；所述菌毛基因簇为：yagV-Z，gltF-yhcF，fimA-H，sfmA-F，ycbQ-F，ydeQ-T，yraH-K，yadC-N，yehA-D，ybgO-D，yfcO-V和/或ygiL-I。