[发明专利]6-磷酸氨基葡萄糖生物传感器及其在菌株筛选中的应用

说明书

本发明涉及一种6‑磷酸氨基葡萄糖生物传感器及其在菌株筛选中的应用，本发明的6‑磷酸氨基葡萄糖生物传感器整合表达在枯草芽孢杆菌的基因组上，包括转录因子GamR、包括GamR结合位点的启动子、采用包括GamR结合位点的启动子来表达的T7 RNA聚合酶，以及采用T7启动子来表达的荧光蛋白。本发明直接实现了6‑磷酸氨基葡萄糖生物传感器在基因组上的整合表达，并通过基于T7 RNA聚合酶的信号放大回路，使荧光表达强度达到直接整合时的3倍。利用该生物传感器对引入突变文库后的微生物菌株进行了高通量筛选，N‑乙酰氨基葡萄糖产量提高了31.6％。

技术领域

本发明属于代谢工程技术领域，尤其涉及一种6-磷酸氨基葡萄糖生物传感器及其在菌株筛选中的应用。

背景技术

通过对微生物细胞的代谢途径进行人为操控构建的微生物细胞工厂，可以用于包括食品、药品、化学品等在内的多种高附加值产品的绿色可持续生产。然而，由于细胞自身复杂的代谢调控机制，为了获得高产的微生物菌株，往往需要对相关代谢途径进行大量的改造和优化。但是常规的测定方法比如液相色谱或质谱的测定速度及通量限制了微生物菌株的测试过程，因此通过构建可以响应相关代谢物的生物传感器，直接将代谢物的浓度转化为荧光蛋白的强度信号，可以实现微生物菌株的高通量筛选。

6-磷酸氨基葡萄糖是氨基葡萄糖、神经氨酸、透明质酸等多种产品合成的重要前体，但是由于细胞自身的代谢调控机制，其在胞内并不能大量积累，这限制了相关产物的和合成过程。因此，可以使用生物传感器对6-磷酸氨基葡萄糖过量积累的微生物菌株进行高通量筛选，并进一步提高氨基葡萄糖、神经氨酸、透明质酸等产物的合成能力。

在专利申请201911174644.1中，我们利用转录因子GamR的作用机制(即6-磷酸氨基葡萄糖浓度较低时GamR会与对应启动子结合抑制其表达，6-磷酸氨基葡萄糖浓度较高时GamR从启动子上脱落恢复其表达)，在枯草芽孢杆菌中构建了一系列具有不同表达强度的6-磷酸氨基葡萄糖激活型启动子，并通过使用上述启动子控制绿色荧光蛋白(GFP)的表达得到了6-磷酸氨基葡萄糖生物传感器。

现有的6-磷酸氨基葡萄糖的生物传感器，其相关的基因元件都是使用质粒表达的，稳定性较差；而且如果直接将其整合到基因组上会使荧光蛋白的表达变弱，从而导致灵敏性降低。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明通过对转录因子GamR及相关基因元件的整合表达，在枯草芽孢杆菌中构建了一种稳定性好的6-磷酸氨基葡萄糖的生物传感器，其可用于6-磷酸氨基葡萄糖高产微生物菌株的高通量筛选。为了避免由于基因组上拷贝数较低而导致荧光信号变弱，本发明利用基于T7 RNA聚合酶的信号放大基因回路对荧光信号进行放大后，增强了该生物传感器的灵敏性。

本发明的第一个目的是提供一种6-磷酸氨基葡萄糖生物传感器，所述的6-磷酸氨基葡萄糖生物传感器整合表达在枯草芽孢杆菌的基因组上，包括转录因子GamR、包括GamR结合位点的启动子、采用包括GamR结合位点的启动子来表达的T7 RNA聚合酶，以及采用T7启动子来表达的荧光蛋白。

进一步地，所述的6-磷酸氨基葡萄糖生物传感器还包括采用核苷酸序列如SEQ IDNO.4所示的RBS调控T7 RNA聚合酶的表达强度。

进一步地，所述的6-磷酸氨基葡萄糖生物传感器还包括在包括GamR结合位点的启动子上添加阻遏蛋白LacI的结合位点lacO。

进一步地，所述的6-磷酸氨基葡萄糖生物传感器还包括在T7启动子的下游添加转录因子GamR的结合位点gamO。

进一步地，所述的包括GamR结合位点的启动子为P_vg6、P_gamA或P_sg2。优选P_sg2，参见专利申请201911174644.1。

进一步地，整合表达的位点为枯草芽孢杆菌基因组的aprE位点。