[发明专利]提高MSC分化为神经前体细胞产量的悬浮摇动培养方法

说明书

本发明涉及一种提高MSC分化为神经前体细胞产量的悬浮摇动培养方法，该方法在第二次传代培养时使用细胞培养摇床进行摇动培养，所述细胞培养摇床的摇动频率为10～20次/分钟、摇动角度为10～20°，第二次传代培养使用未经过“促进细胞贴壁”处理的细胞培养器皿，能够进一步提高神经前体细胞的产量。使用所述的悬浮摇动培养方法对间充质干细胞(MSC)进行培养，可以提高间充质干细胞分化成神经前体细胞的效率，提高神经前体细胞的产量。

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，特别涉及一种提高MSC分化为神经前体细胞产量的悬浮摇动培养方法。

背景技术

中枢神经系统损伤或发育不良会引起神经细胞凋亡、神经组织缺损、运动及思维等能力缺陷，最终导致终身残疾甚至寿命缩短。中枢神经系统自我修复能力极低，治疗此类疾病需要使用细胞替代疗法，对凋亡缺损的神经细胞和组织进行补充，进而恢复神经系统的功能。

神经前体细胞(Neural progenitor cells，NPC)在神经系统发育和神经损伤修复过程中起重要作用，成体神经损伤修复困难与NPC缺乏或沉默有关。既往的研究表明，移植同种异体NPC能缓解帕金森、多发性硬化、脑胶质瘤等疾病，能促进神经退行性疾病、外伤等轴突损伤髓鞘新生和修复，缓解临床症状，但NPC来源极为有限，限制了其临床应用。成体NPC的分离依赖于组织学部位，一般成年人体内很难取材，而流产胎儿脑组织分离NPC又受到伦理学限制，样本资源成为限制NPC研究和应用的瓶颈。近些年来，对干细胞分化机制的研究取得了很大进展，发现胚胎干细胞和多种成体干细胞有神经前体细胞分化潜能，为神经前体细胞制备提供了新的思路。间充质干细胞(Mesenchymal stem cell，MSC)是样本资源最丰富的成体干细胞，是基于干细胞再生医学的最有前景的种子细胞。脂肪、脐带、骨髓等多种组织来源的间充质干细胞能分化成Netstin阳性神经前体细胞，具有神经元、神经胶质细胞等的分化潜能。

目前的研究发现，使用EGF、bFGF等细胞因子可以诱导MSCs向神经组织细胞分化。但如果要得到均一性高的Nestin+神经前体细胞则需要经过神经球培养阶段。神经球培养是将MSC接种至疏水培养容器中培养，形成多细胞聚集的细胞球，属于半悬浮培养体系，其培养容量小、操作复杂、难于传代扩增，导致细胞收率低，限制了基于神经前体细胞的神经组织修复医学的产业化转化。

发明内容

针对现有技术中的缺陷，本发明提出了一种提高MSC分化为神经前体细胞产量的悬浮摇动培养方法，该方法在第二次传代培养时使用细胞培养摇床进行摇动培养，所述细胞培养摇床的摇动频率为10～20次/分钟、摇动角度为10～20°，使用所述的悬浮摇动培养方法对间充质干细胞(MSC)进行培养，可以提高间充质干细胞分化成神经前体细胞的效率，提高神经前体细胞的产量。

本发明提供一种提高MSC分化为神经前体细胞产量的悬浮摇动培养方法，包括如下步骤：

(1)分离间充质干细胞，原代培养；

(2)将原代培养后的间充质干细胞传代接种于细胞培养器皿表面，添加细胞培养基，进行第一次传代培养；

(3)将第一次传代培养后的间充质干细胞再次传代接种于细胞培养器皿表面，添加无血清成分的细胞培养基，进行第二次传代培养；

(4)用细胞培养摇床进行摇动培养，收获神经前体细胞；

所述细胞培养摇床的摇动频率为10～20次/分钟、摇动角度为10～20°。

进一步的，所述细胞培养摇床的摇动频率为15次/分钟、摇动角度为15°。实验证明摇动频率15次/分钟、摇动角度15°的设置下神经前体细胞的产量最高。

进一步的，所述步骤(1)中所述的间充质干细胞来源于人类。来源于人类的间充质干细胞用于获得人神经前体细胞，可应用于人神经性疾病的治疗。