[发明专利]一种快速鉴定植物叶绿体完整性的方法

说明书

本发明属于生物技术领域，公开了一种快速鉴定植物叶绿体完整性的方法，所述方法包括如下步骤：1)提取植物细胞中的叶绿体；2)分离破碎的植物细胞中的叶绿体；3)将需要鉴定的叶绿体组分转移，离心收集，重悬后得到叶绿体悬液；4)将荧光染料加入叶绿体悬液中，使叶绿体膜被染色；5)通过荧光显微镜观察叶绿体膜的完整性区分完整和破损的叶绿体。本发明采用罗丹明B和尼罗红等荧光染料对多种植物的叶绿体进行染色，能够快速、直观地显示叶绿体的完整性，对叶绿体的研究具有重要意义。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种快速鉴定植物叶绿体完整性的方法。

背景技术

叶绿体是植物进行光合作用的主要场所，是植物特有的细胞器。它还参与脂肪酸、氨基酸、维生素和激素等重要物质的合成。此外，叶绿体在植物体内还具有其他很多重要的生理功能。因此，对于叶绿体的研究一直是生物学领域的热点。

如何从植物细胞中分离出来完整的叶绿体是很多研究者在实验中遇到的问题。常用的提取叶绿体的方法主要是percoll密度梯度离心法。该方法旨在通过密度梯度离心的方法将破损的叶绿体与完整的叶绿体进行分离。其原理是提取过程中破损的叶绿体由于内含物的泄露导致密度降低，从而在离心管中处于上层，而完整的叶绿体由于密度较大，从而处于离心管的中部。

密度梯度离心是分离完整叶绿体和破损叶绿体的常用方法，但是由于叶绿体中经常含有较多的淀粉，在离心的过程当中，破损的叶绿体由于含有淀粉导致密度增加也会在离心力的作用下沉入到中层完整叶绿体中。因而，“中层叶绿体”中有多少完整的叶绿体并不确定，有时大部分都是破损的叶绿体。如果盲目相信中层的叶绿体都是完整的叶绿体，有可能会造成严重的错误。

此外，人们还采用蛋白质凝胶电泳以及随后的染色或免疫印迹的方法，根据分离得到的叶绿体中有关蛋白的比例大概推断其完整性，但是该方法所耗时间较长(需要一天时间)，且不能准确和直观地反映出完整叶绿体所占比例。该方法与离心方法都不能直观、可视化地展示完整叶绿体的形态、大小以及所占的比例。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，开发一种快速鉴定植物叶绿体完整性的方法，以便人们更好地深入研究叶绿体的功能。本发明采用罗丹明B(Rhodamine B)和尼罗红(Nile red)等荧光染料，对percoll密度梯度离心分离后得到的叶绿体的膜进行染色，利用荧光显微镜进行观察，可以快速、清晰直观地显示出叶绿体的完整性以及叶绿体的大小、形态，从而确定密度梯度离心分离后得到的“中层叶绿体”中完整叶绿体所占比例。本发明使用罗丹明等染料染色，只需几分钟时间，便可用荧光显微镜观察。

为实现上述技术问题，本发明提供了一种快速鉴定植物叶绿体完整性的方法，所述方法包括如下步骤：

1)提取植物叶片叶绿体：将植物叶片剪碎放入破碎缓冲液GB中，然后进行破碎、过滤和离心收集得到总叶绿体；

2)分离叶绿体：通过密度梯度离心分离破碎的叶片细胞中的总叶绿体，得到上层破碎叶绿体和中层叶绿体；

3)离心收集与重悬：将需要鉴定的叶绿体组分进行转移，离心收集后重悬得到叶绿体悬液；

4)叶绿体染色：将荧光染料加入到叶绿体悬液中，使叶绿体膜被染色；

5)叶绿体完整性分析：通过荧光显微镜观察荧光染料对叶绿体的染色情况，比较破损叶绿体与完整叶绿体的染色差异，观察叶绿体膜的完整性区分完整和破损的叶绿体。

在本发明的技术方案中，步骤1)中，植物细胞中叶绿体的提取方法为：将待提取叶绿体的植物材料剪碎放入破碎缓冲液GB中，然后进行破碎、过滤和离心收集得到叶绿体。

在本发明的技术方案中，所述植物为含有叶绿体的植物材料，优选的，所述植物选自烟草叶片、菠菜叶片、豌豆叶片、玉米叶片、拟南芥叶片中的一种。