[发明专利]一种基于ddPCR的CD45基因分型检测、小鼠骨髓重建能力检测方法及应用

说明书

本发明公开了一种基于ddPCR的CD45基因分型检测、小鼠骨髓重建能力检测方法及应用。提取小鼠的基因组DNA，利用荧光标记的CD45.1、CD45.2检测探针，通过ddPCR技术对CD45.1和CD45.2抗原进行定量，从而检测小鼠骨髓重建能力；上游序列为SED ID No.1，下游序列为SED ID No.2，CD45.1检测探针的序列为SED ID No.3,CD45.2检测探针的序列为SED ID No.4。本方法只需要少量的血液样本，无需购买昂贵的抗体即可对CD45.1和CD45.2抗原进行定量，从而量化基因修饰细胞和非基因修饰细胞，并据此评估基因修饰对小鼠骨髓重建能力的影响。

技术领域

本发明具体涉及一种基于ddPCR的CD45基因分型检测、小鼠骨髓重建能力检测方法及应用。

背景技术

CD45由一类结构相似，分子量较大的跨膜蛋白组成，广泛存在于白细胞表面，其胞浆区段具有蛋白质酪氨酸磷酸酶的作用，能使底物P56lck和P59fyn上酪氨酸脱磷酸而激活，在细胞的信息传导中发挥重要作用，CD45是细胞膜上信号传导的关键分子，在淋巴细胞的发育成熟，功能调节及信号传递中具有重要意义，CD45的分布可作为某些T细胞亚群的分类标志。据报道现在已在小鼠中鉴定出不同的CD45亚型，常见形式是CD45.2，在C57BL/6小鼠表达，它是由Ptprcb等位基因编码的。而在SJL小鼠品系中鉴定出了另一个等位基因变体Ptprca，该变体翻译成表面蛋白的CD45.1形式。该CD45.1等位基因已成功回交至BL/6背景，并已广泛用于免疫学研究中，以追踪特定基因对造血细胞发育的贡献。

在竞争性的同基因骨髓移植模型中，用来自CD45.1和CD45.2供体的1：1嵌合骨髓混合物重建受辐照的宿主小鼠，从而能够独立跟踪和量化来自每个供体的重组造血细胞。当这些测定包括基因修饰小鼠时，这些动物通常可在BL/6背景上使用，与携带CD45.1表位的野生型细胞一起重建时，可通过CD45.2标记鉴定出基因修饰细胞，进而我们可以通过CD45.1和CD45.2来量化基因修饰细胞和非基因修饰细胞，从而依据此来评估该基因修饰对小鼠骨髓重建能力的影响。

现在有越来越多的实验都用到竞争性骨髓移植模型，比如在研究某种基因修饰对小鼠造血能力的影响时，我们通常会对CD45.1或者CD45.2供体小鼠用致死剂量(10Gy)钴60(60Co)射线全身照射，两周后，然后再用CD45.1或者CD45.2供体小鼠骨髓移植到辐照后的受体小鼠身上，一定时间后，再对CD45.1或者CD45.2抗原进行定量，从而依据此评估基因修饰细胞和非基因修饰细胞在小鼠骨髓重建中的能力。现在我们对CD45.1或者CD45.2抗原的定量主要是利用基于流式抗体的方式，这种方法成本高、需要的样本量大、仪器操作复杂。

微滴式数字PCR(ddPCR)系统在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成数万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后，对每个微滴的荧光信号进行逐一分析，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种基于ddPCR的CD45基因分型检测、小鼠骨髓重建能力检测方法及应用，解决了上述背景技术中利用基于流式抗体的方式对CD45.1或者CD45.2抗原定量时成本高、需要的样本量大、仪器操作复杂的问题。

本发明解决其技术问题所采用的技术方案之一是：提供了一种基于ddPCR的小鼠骨髓重建能力检测方法，提取小鼠的基因组DNA，利用荧光标记的CD45.1检测探针、CD45.2检测探针，通过ddPCR技术对CD45.1和CD45.2抗原进行定量，从而检测小鼠骨髓重建能力；其中，上游序列为SED ID No.1，下游序列为SED ID No.2，CD45.1检测探针的序列为SED IDNo.3,CD45.2检测探针的序列为SED ID No.4。