[发明专利]一种基于ddPCR的CD45基因分型检测、小鼠骨髓重建能力检测方法及应用有效
| 申请号： | 202110048363.2 | 申请日： | 2021-01-14 |
| 公开（公告）号： | CN112608996B | 公开（公告）日： | 2022-05-10 |
| 发明（设计）人： | 张永有;胡会龙 | 申请（专利权）人： | 厦门大学 |
| 主分类号： | C12Q1/6883 | 分类号： | C12Q1/6883;C12Q1/6851 |
| 代理公司： | 厦门市首创君合专利事务所有限公司 35204 | 代理人： | 张松亭;陈丹艳 |
| 地址： | 361000 *** | 国省代码： | 福建;35 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 基于 ddpcr cd45 基因 检测 小鼠 骨髓 重建 能力 方法 应用 | ||
1.一种基于ddPCR的小鼠骨髓重建能力检测方法，其特征在于：提取小鼠的基因组DNA，利用荧光标记的CD45.1检测探针、CD45.2检测探针，通过ddPCR技术对CD45.1和CD45.2抗原进行定量，从而检测小鼠骨髓重建能力；其中，上游序列为SED ID No.1，下游序列为SED IDNo.2，CD45.1检测探针的序列为SED ID No.3,CD45.2检测探针的序列为SED ID No.4。
2.根据权利要求1所述的一种基于ddPCR的小鼠骨髓重建能力检测方法，其特征在于：所述CD45.1检测探针的5′端标记FAM荧光基团，3′端标记淬灭基团。
3.根据权利要求1所述的一种基于ddPCR的小鼠骨髓重建能力检测方法，其特征在于：所述CD45.2检测探针的5′端标记HEX荧光基团，3′端标记淬灭基团。
4.根据权利要求1所述的一种基于ddPCR的小鼠骨髓重建能力检测方法，其特征在于：所述CD45.1检测探针、CD45.2检测探针的反应温度为60-65℃。
5.根据权利要求1所述的一种基于ddPCR的小鼠骨髓重建能力检测方法，其特征在于：所述ddPCR的反应体系共20μL，组分如下：
DEPC-H2O 12.4μL，10XddPCR supermix 2μL，上游引物50μM/0.2μL，下游引物50μM/0.2μL，CD45.1检测探针50μM/0.1μL，CD45.2检测探针50μM/0.1μL，模板基因组DNA 50ng/5μL。
6.根据权利要求5所述的一种基于ddPCR的小鼠骨髓重建能力检测方法，其特征在于：所述模板基因组包括序列为SED ID No.5的CD45.1模板和序列为SED ID No.6的CD45.2模板。
7.根据权利要求5所述的一种基于ddPCR的小鼠骨髓重建能力检测方法，其特征在于：所述ddPCR的反应程序如下：
8.如权利要求1～7任一项所述的一种基于ddPCR的小鼠骨髓重建能力检测方法的应用，其特征在于：在竞争性的骨髓移植模型中，提取受体小鼠的基因组DNA；利用如权利要求1～6任一项所述方法对CD45.1和CD45.2抗原进行定量，从而量化基因修饰细胞和非基因修饰细胞，并据此评估基因修饰对小鼠骨髓重建能力的影响。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：受体小鼠的基因组DNA提取包括如下步骤：在竞争性的骨髓移植模型，取2mL受体小鼠血液，经过红细胞裂解液除去红细胞、破碎白细胞、除去杂蛋白、获得基因组DNA。
10.一种基于ddPCR的CD45基因分型检测方法，其特征在于：采集待测血样提取基因组DNA，利用荧光标记的CD45.1检测探针、CD45.2检测探针，通过ddPCR技术对CD45.1和CD45.2抗原进行定量；其中，上游序列为SED ID No.1，下游序列为SED ID No.2，CD45.1检测探针的序列为SED ID No.3,CD45.2检测探针的序列为SED ID No.4。
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