[发明专利]一种弱光处理显著提高桃叶片瞬时转化效率的方法

说明书

本发明属于生物技术领域，涉及桃叶片瞬时转化方法，特别是指一种桃实生苗叶片瞬时转化方法。本发明主要解决的问题是桃叶片转化效率低的问题。具体的方法如下：（1）经低温（4℃）沙藏的桃核，去除其外部坚硬的内果皮，将种子播于营养土中，并置于温度为22℃，湿度为75%，光照为6000‑8000lux的环境下培养；（2）将10‑15 d苗龄的桃实生苗置于光照强度为600‑800 lux条件下，培养5‑8天，待用；（3）选取经步骤（2）处理后的桃苗，以常规农杆菌介导的叶片抽真空方法进行瞬时转化。经弱光处理的桃实生苗叶片转化效率极显著提高，与常规转化方法相比，瞬时转化GUS基因后，GUS活性提高了5.64倍。

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及桃叶片瞬时转化方法，特别是指一种桃实生苗叶片瞬时转化方法。

背景技术

桃是我国重要的落叶果树之一，其果实多汁、香甜，深受消费者喜爱，具有极高的经济价值。随着桃基因组测序工作的完成以及高通量测序技术的发展，针对桃重要农艺性状的研究已深入到分子层面。由于桃尚未构建出成熟的稳定遗传转化体系，因此验证桃基因的功能及其调控机理任然是目前研究人员经常面临的难题。

在果树研究领域，缺少成熟稳定的遗传转化体系是一个较为常见的现象，例如石榴、梨、枣等。为解决这一问题，瞬时转化方法被广泛利用。目前在桃上，成熟桃果实的瞬时转化方法已较为成熟，可被应用于研究桃基因功能。然而，成熟桃果实中蛋白含量急剧减少，因此成熟桃果实的瞬时转化方法不适合应用于桃基因调控机理的研究。因此，开发出一种新的桃瞬时转化方法则显得尤为必要。利用叶片进行瞬时转化方法，进而研究基因的调控机理是一个广受业内认可的方法。目前，有关桃叶片瞬时转化的研究极少且转化效率非常低。

因此，在桃稳定转化技术难题尚未被攻克的背景下，开发出可应用于基因功能和基因调控基因研究的桃叶片瞬时转化方法，具有重要研究意义。同时，与稳定转化相比，瞬时转化方法具有简单，快速和高效的特点。

发明内容

本发明提出一种高效桃叶片瞬时转化方法，解决了桃叶片瞬时转化效率低的技术问题。

本发明的技术方案为：

（1）当年收桃核经低温4℃沙藏处理2月后，去除外部坚硬内果皮，将种子播于营养土中，并置于温度为22℃，湿度为75%，光照为6000-8000lux的环境下培养；

（2）将10-15 d苗龄的桃实生苗置于光照强度为600-800 lux条件下，培养5-8天，待用；

（3）选取经步骤（2）处理后的桃苗，以常规农杆菌介导的叶片抽真空方法进行瞬时转化。

进一步的，步骤（1）中所述去除内果皮时切勿损坏种子。

进一步的，步骤（1）中所述播种时应将种子胚根一端的种皮去除，并将胚根一端插入到土里进行播种。

进一步的，步骤（2）中所述10-15d苗龄的桃苗，其株高应尽量为15-20 cm。

进一步的，步骤（2）中所述桃苗在600-800 lux条件下，培养5-8天后，其叶片表现为叶宽略微增加，叶色变暗。

上述方法在快速验证基因功能中的应用。

本发明具有以下有益效果：