[发明专利]一种基于切离酶基因编辑技术的定向修复系统

说明书

本申请公开一种基于切离酶基因编辑技术的定向修复系统，其利用核酸酶失活的Cas9结构域和指导RNA来定向基因位点，再利用切离酶来删除靶向目的基因的基因靶点进行定向修复，能够避免随机修复，为长距离定向基因删除提供了特异性定向修复能力。用以解决现有的CRISPR/Cas9酶切技术进行定向的基因编辑，CRISPR/Cas9酶切技术只能敲除靶向目的基因位点基因序列切割，如果去除基因组中的长片段，单独CRISPR/Cas9技术是无法实现，需要设计两个指导RNA序列；而且CRISPR/Cas9技术切除基因片段之后，其修复只能依赖于细胞内的随机修复系统的技术问题。

技术领域

本申请涉及生物基因技术领域，尤其涉及一种基于切离酶基因编辑技术的定向修复系统。

背景技术

基因编辑技术指能够让微生物、动物和人类的细胞目标基因进行“编辑”，实现对靶点DNA片段的敲除和加入等的一项技术。自CRISPR/Cas9技术自问世以来，就有着其它基因编辑技术无可比拟的优势，技术不断改进后，更被认为能够在活细胞中最有效、最便捷地“编辑”任何基因。如果想使某个基因的功能丧失，可以在这个基因上产生位点切割，非同源末端连接修复的过程中往往会产生DNA的插入或删除，造成移码突变，从而实现基因敲除。

切除酶(又称切除酶；切割酶或切离酶)是由XIS基因编码的噬菌体蛋白，可以切除噬菌体插入细菌基因组的基因。采用了一种不寻常的翼状螺旋结构，其中两个α螺旋被包装在两个延伸的链上。结构中还存在一个双链反平行β-折叠片，其股线通过四残余翼连接。在与DNA相互作用期间，螺旋α被认为插入主沟中，而翼接触相邻的小沟或磷酸二酯骨干。切除酶的C末端区域参与与噬菌体编码的整合酶的相互作用。

现有CRISPR/Cas9酶切技术进行定向的基因编辑，CRISPR/Cas9酶切技术只能敲除靶向目的基因位点基因序列切割，如果去除基因组中的长片段，单独CRISPR/Cas9技术是无法实现，需要设计两个指导RNA序列；而且CRISPR/Cas9技术切除基因片段之后，其修复是依赖于细胞内的随机修复系统。

发明内容

本申请实施例提供了一种基于切离酶基因编辑技术的定向修复系统，用以解决现有的CRISPR/Cas9酶切技术进行定向的基因编辑，CRISPR/Cas9酶切技术只能敲除靶向目的基因位点基因序列切割，如果去除基因组中的长片段，单独CRISPR/Cas9技术是无法实现，需要设计两个指导RNA序列；而且CRISPR/Cas9技术切除基因片段之后，其修复是依赖于细胞内的随机修复系统的技术问题。

有鉴于此，本申请提供了一种基于切离酶基因编辑技术的定向修复系统，所述基因编辑定向修复系统建立在质粒的基础上，包括质粒载体；

所述质粒载体包括：编辑器和指导RNA，所述编辑器与所述指导RNA为非共价结合；

所述编辑器包括用于定向的核酸酶失活的Cas9结构域和XIS切离酶复合体；

所述指导RNA包含编码靶向区域的crRNA和特异性靶向基因；

所述核酸酶失活的Cas9结构域用于与所述指导RNA定向结合定位特异性位点，所述XIS切离酶复合体用于定向切除特异性靶向基因片段。