[发明专利]ApoE基因缺失斑马鱼的制备

说明书

本发明利用CRISPR/Cas9技术，构建成了ApoE基因缺失斑马鱼，具体步骤包括：1)根据ApoE基因序列，确定ApoE靶位点；2)制备gRNA；3)体外转录Cas9mRNA；4)将Cas9mRNA和gRNA混合，注射到单细胞期斑马鱼胚胎中；5)将F₀胚胎饲养至性成熟；6)与野生型成鱼外交，筛选F₀；7)选取可产生有效突变的F₀自交，筛选F₁；8)从F₁代突变体中挑选相同突变的雌鱼和雄鱼，杂交得到F₂代；9)筛选ApoE基因敲除纯合子即为稳定遗传的ApoE基因缺失斑马鱼。本发明构建的ApoE基因缺失斑马鱼可稳定遗传，可用于阿尔兹海默症、骨质疏松、冠心病疾病的研究。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及ApoE基因缺失斑马鱼的制备。

背景技术

人的ApoE是一个由299个氨基酸组成的糖蛋白，在多种器官中表达，表达量最高的是肝脏，其次是大脑。大脑中表达ApoE的细胞主要是一些非神经元细胞，ApoE和Aβ相互作用，在阿尔兹海默症发病中扮演了重要角色。在周边和中枢神经系统中，神经元损伤后ApoE表达会大量增加，一些研究表明ApoE在维持神经的可塑性和功能方面十分重要。近年来，国内外学者认为ApoE是骨质疏松症的候选基因之一，ApoE基因多样性与骨量流失和骨质疏松性具有相关性。ApoE基因多态性与冠心病发生有密切关系，ApoE基因变异对冠心病的危险性有强烈而持续的影响。

斑马鱼性成熟时间短，出生后3个月就可以达到性成熟，繁殖能力强，饲养成本低，生命周期短，胚胎体外发育且透明，所需药物少，非常适宜用于阿尔兹海默症、骨质疏松、冠心病的研究。

发明内容

本发明的目的是利用CRISPR/Cas9系统构建一种ApoE基因缺失斑马鱼。

本发明的制备过程如下：

本发明靶位点DNA序列为：5’-GGATGGCGCCACCCAGAAAC-3’。

本发明提供一种基因打靶试剂盒，所述试剂盒包括两条Oligo序列，其序列为5’-GGATGGCGCCACCCAGAAAC-3’，5’-AAACGTTTCTGGGTGGCGCCAT-3’，使用该试剂盒可以用于ApoE基因表达的沉默。

本发明提供了一种基因敲除方法，所述方法的步骤如下：利用所述的Oligo片段识别目的基因的靶位点，与Cas9结合并识别靶位点处PAM序列，引导核酸酶结合到目的基因靶位点处，并开始进行剪切，形成DSB缺口，随后细胞通过非同源末端连接修复机制修复目的基因双链，造成移码突变，最终目的基因被敲除。

进一步的，所述靶点为一个或以上。

进一步的，本发明提供ApoE基因缺失斑马鱼的制备方法，所述制备方法包括：

1.根据ApoE基因序列，确定ApoE靶位点；

2.根据ApoE靶位点，设计Oligo序列；

3.构建gRNA体外转录载体；

4.PCR获得gRNA体外转录模板；

5.对步骤4获得的模板进行体外转录，得到gRNA；

6.制备Cas9 mRNA的体外转录模板；

7.体外转录Cas9 mRNA；

8.添加polyA序列、回收Cas9 mRNA；

9.将Cas9 mRNA和gRNA混合，注射到单细胞期斑马鱼胚胎中；

10.将F₀胚胎饲养至性成熟；