[发明专利]绿盲蝽乙酰胆碱酯酶A216S突变快速分子检测方法

说明书

本发明公开了一种基于环介导恒温扩增技术LAMP建立一种对绿盲蝽乙酰胆碱酯酶A216S突变的快速检测方法，属于害虫抗药性分子检测和害虫综合防治范畴。本技术旨在解决绿盲蝽乙酰胆碱酯酶A216S突变的快速分子检测，并由此判断绿盲蝽是否对毒死蜱产生抗药性。技术要点包括：提取单头绿盲蝽成虫基因组DNA；设计2对特异性引物；建立LAMP反应体系；明确LAMP反应程序；确定反应结果的颜色判定标准。本方法稳定性好、灵敏度高、用时短、操作简便，可为田间绿盲蝽的抗药性监测和抗药性早期预警提供技术支持，为绿盲蝽的科学防治、合理选药提供准确的判定标准，同时也为植保基层工作者提供简便易行的分子检测手段。

技术领域

本发明涉及一种检测方法，尤其涉及一种绿盲蝽乙酰胆碱酯酶A216S突变快速分子检测方法。

背景技术

自20世纪90年代中期以来，为防控棉铃虫，转基因抗虫棉在我国大面积的推广种植。转基因抗虫棉的种植对靶标害虫棉铃虫的种群密度有了很好的控制，同时也大大减少了化学杀虫剂在棉田中的使用量。没有了广谱杀虫剂的防控，棉田中的棉蚜、盲蝽等刺吸式口器害虫的种群密度显著上升。由于在棉田中天敌较少，使其数量无法得到有效的控制，盲蝽在我国长江、黄河和沿海三大棉区为害严重，逐渐成为我国棉花上的主要害虫，其中绿盲蝽Apolygus lucorum是危害我国长江、黄河流域棉花生长的优势种群之一。

目前化学防治依然是控制绿盲蝽为害的有效手段，为防治绿盲蝽在棉田的为害，加大了化学杀虫剂的使用量与使用频率。长期过度的依赖化学防治，使得田间绿盲蝽种群对多种杀虫剂的敏感性下降，产生了抗药性问题。已有研究表明绿盲蝽已对有机磷类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类及环戊二烯类的多种杀虫剂产生了不同程度的抗药性。2011年到2014年在黄河流域及长江流域采集的绿盲蝽田间种群对毒死蜱的抗药性进行了检测，结果表明山东滨州和河北沧州绿盲蝽田间种群对毒死蜱产生了低到中等水平的抗药性。

发明内容

发明目的：本发明的目的在于提供一种基于LAMP检测技术，通过解决特异性引物、反应温度条件、结果判定标准等三个主要技术环节，建立绿盲蝽乙酰胆碱酯酶A216S突变的更为便捷准确的基因分子检测方法。

技术方案：本发明的绿盲蝽乙酰胆碱酯酶A216S突变快速分子检测方法，包括以下步骤：

(1)提取单头绿盲蝽成虫基因组DNA，并制备gDNA模板；

(2)在反应容器中建立LAMP反应体系，包括LAMP反应液、特异性引物、显色试剂，并补充水；

(3)将反应容器放入加热容器中加热反应；

(4)LAMP反应后，含A216S突变的反应溶液的颜色发生明显变化-，不含A216S突变的反应溶液颜色不变。

进一步地，步骤(2)中，所述LAMP反应液包括Bst DNA聚合酶和gDNA模板、所述特异性引物包括内引物FIP/BIP和外引物FOP/BOP、所述显色试剂包括羟基萘酚蓝和甜菜碱。

进一步地，所述的LAMP反应液包含Bst DNA聚合酶4-8U·μL^-1、10×Thermo Pol2.5μL、Mg²⁺4.0-6.0nmol·μL^-1、dNTP 1.0-1.4nmol·μL^-1、gDNA模板1.0-2.0μL。

进一步地，所述内引物FIP/BIP的浓度为1.2-1.6μmol·L^-1；所述外引物FOP/BOP的浓度为0.2-0.5μmol·L^-1。

进一步地，所述内引物FIP/BIP序列分别为：

FIP：CCGGAGCTCTCCCCGAAGAGCAACATCGACAAGTTCGGCG；