[发明专利]绿盲蝽乙酰胆碱酯酶A216S突变快速分子检测方法在审

申请号：	202110042966.1	申请日：	2021-01-13
公开（公告）号：	CN112609008A	公开（公告）日：	2021-04-06
发明（设计）人：	武淑文;沈慧雯;梁常安;杨亦桦;王兴亮	申请（专利权）人：	南京农业大学
主分类号：	C12Q1/6888	分类号：	C12Q1/6888;C12Q1/6844;C12N15/11
代理公司：	南京苏高专利商标事务所(普通合伙) 32204	代理人：	柏尚春
地址：	210095 ***	国省代码：	江苏;32
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摘要：
搜索关键词：	绿盲蝽乙酰胆碱酯酶 a216s 突变快速分子检测方法
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【权利要求书】：

1.一种绿盲蝽乙酰胆碱酯酶A216S突变快速分子检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取单头绿盲蝽成虫基因组DNA，并制备gDNA模板；

(2)在反应容器中建立LAMP反应体系，包括LAMP反应液、特异性引物、显色试剂，并补充水；

(3)将反应容器放入加热容器中加热反应；

(4)LAMP反应后，含A216S突变的反应溶液的颜色发生明显变化，不含A216S突变的反应溶液颜色不变。

2.根据权利要求1所述的绿盲蝽乙酰胆碱酯酶A216S突变快速分子检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述LAMP反应液包括Bst DNA聚合酶和gDNA模板、所述特异性引物包括内引物FIP/BIP和外引物FOP/BOP、所述显色试剂包括羟基萘酚蓝和甜菜碱。

3.根据权利要求2所述的绿盲蝽乙酰胆碱酯酶A216S突变快速分子检测方法，其特征在于，所述的LAMP反应液包含Bst DNA聚合酶4-8U·μL^-1、10×Thermo Pol 2.5μL、Mg²⁺4.0-6.0nmol·μL^-1、dNTP 1.0-1.4nmol·μL^-1、gDNA模板1.0-2.0μL。

4.根据权利要求2所述的绿盲蝽乙酰胆碱酯酶A216S突变快速分子检测方法，其特征在于，所述内引物FIP/BIP的浓度为1.2-1.6μmol·L^-1；所述外引物FOP/BOP的浓度为0.2-0.5μmol·L^-1。

5.根据权利要求2或4所述的绿盲蝽乙酰胆碱酯酶A216S突变快速分子检测方法，其特征在于，所述内引物FIP/BIP序列分别为：

FIP：CCGGAGCTCTCCCCGAAGAGCAACATCGACAAGTTCGGCG；

BIP：GCCGTTTCCGTCTCCCTCCCCGAACCGCTTTCCATGA；

所述外引物FOP/BOP序列分别为：

FOP：GCTCCAGTGGGTCAGGAA；

BOP：GCCCAAGGCGCAACTG。

6.根据权利要求2所述的绿盲蝽乙酰胆碱酯酶A216S突变快速分子检测方法，其特征在于，所述甜菜碱的浓度为0.4-0.6mol·L^-1、所述羟基萘酚蓝的浓度为150-180μmol·L^-1。

7.根据权利要求2所述的绿盲蝽乙酰胆碱酯酶A216S突变快速分子检测方法，其特征在于，步骤(4)中，所述含A216S突变的反应溶液的颜色变化为天蓝色，所述不含A216S突变的反应溶液的颜色为紫罗兰色。

8.根据权利要求1所述的绿盲蝽乙酰胆碱酯酶A216S突变快速分子检测方法，其特征在于，步骤(2)中，所述水为无菌纯水，用量为补足20-25μL反应体系。

9.根据权利要求1所述的绿盲蝽乙酰胆碱酯酶A216S突变快速分子检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述加热温度为54℃～66℃。

10.根据权利要求1所述的绿盲蝽乙酰胆碱酯酶A216S突变快速分子检测方法，其特征在于，步骤(3)中，所述反应时间为60-70min。