[发明专利]靶向编辑VEGFA基因外显子区域的gRNA及其应用

说明书

本发明涉及一种靶向编辑VEGFA基因外显子区域的gRNA及其应用，属于基因编辑技术领域。所述gRNA序列靶向破坏VEGFA基因的的外显子区域，所述gRNA序列的靶向结构域序列选自SEQ ID NO:5‑21，SEQ ID NO:25‑53中任一所示基础序列，或与所述基础序列相似性≥90％的扩展序列。采用该gRNA序列，特异性靶向破坏VEGFA基因启动子区域而有效降低VEGFA mRNA水平。从而治疗癌症、年龄相关性黄斑变性、糖尿病肾病、类风湿性关节炎、牛皮癣皮肤、卵巢过度刺激综合征等有关疾病。

技术领域

本发明涉及基因编辑技术领域，特别是涉及一种靶向编辑VEGFA基因外显子区域的gRNA及其应用。

背景技术

血管内皮生长因子A(Vascular endothelial growth factor A,VEGFA)参与的新生血管信号通路调控多种生物体生理过程及疾病相关信号通路，如从胚胎发育到各个器官、组织的血管新生过程。当特定组织或器官处于缺氧状态时，细胞中VEGFA会被缺氧诱导因子HIF转录因子激活并表达上调，表达上调的VEGFA结合其受体，激活新生血管信号途径，为机体提供养分。而在各种癌症等疾病中，组织均处于缺氧状态，VEGFA都会被显著性上调表达，激活新生血管途径。研究发现，VEGFA相关新生血管信号途径会在各种病理过程中上调，如肺癌、乳腺癌、肝癌、胶质母细胞瘤等各种癌症病程，以及糖尿病肾病、类风湿性关节炎、牛皮癣皮肤、卵巢过度刺激综合征等各大疾病中VEGF明显上调表达。

已经上市VEGF抗体阿柏西普及正在临床试验的过表达anti-VEGF的药物RGX-314都被用于治疗糖尿病性黄斑水肿(diabetic macular edema，DME)，视网膜静脉闭塞后斑斑水肿(Macular Edema Following Retinal Vein Occlusion，RVO)、糖尿病视网膜病变(Diabetic Retinopathy，DR)等，且效果较佳。拜耳公司的anti-VEGF阿柏西普(Aflibercept)用于结直肠癌的试验已经处于临床三期，同时用于非小细胞肺癌也处于临床三期试验。基因泰克公司的Anti-VEGF贝伐珠单抗(Bevacizumab)用于治疗结肠癌、肺癌、乳腺癌、胶质瘤母细胞瘤和肾癌等，治疗结肠癌和乳腺癌的临床试验已经进入三期。但频繁玻璃体注射抗体药严重影响病人生活质量，因此开发一款永久性下调VEGFA的药物对于人类健康具有极强的必要性和紧迫性。

年龄相关性黄斑变性(age related macular degeneration,AMD)已成为全球50岁以上老年人的首要致盲原因，造成不可逆转的视力损伤。AMD分为干性或称萎缩性和新生血管性或称湿性。其中10-15％为新生血管性年龄相关性黄斑变性(neovascular agerelated macular degeneration，nAMD)，是引起视力丧失的最主要原因之一。nAMD患者临床症状为逐渐或突然产生严重视力障碍，眼底出血、渗出并伴有脉络膜新血管生成及黄斑区盘状瘢痕。新生血管性年龄相关性黄斑变性发病始于50岁，在60岁以上老年人群中发病率高达13％。目前研究已证明，nAMD的关键分子机制是视网膜色素上皮细胞(retinalpigment epithelium,RPE)因遗传或外界压力刺激过量表达血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor,VEGFA)，从而激活新血管生成信号通路，造成视网膜渗血，严重损伤视力。因此，通过眼部玻璃体注射VEGF抗体药，能够有效抑制视网膜和脉络膜新血管生成和中央视力损伤的恶化。

玻璃体注射VEGF抗体药是目前治疗nAMD效果较好且市场份额最大的治疗方案。然而所有VEGF抗体药均需每隔1-3个月进行玻璃体注射，过于频繁的玻璃体注射以及高昂费用，带给老年人难以承受的术后生活和经济压力。