[发明专利]一种贻贝黏蛋白的生物制备方法

说明书

本发明提供了一种贻贝黏蛋白的生物制备方法，包括将蛋白序列rMAP‑3、rMAP‑5分别克隆至表达载体pET22b(+)，再转化进BL21(DE3)感受态细胞；涂布于LB‑Amp培养基上37℃培养及逐级扩大培养，再接种于不含Amp的LB培养基中生长至OD₆₀₀6.0后，加入终浓度1mM IPTG诱导，37℃表达5hrs，离心收集菌体；经纯化后获得蛋白纯度90％的包涵体；最终处理获得蛋白溶液。本发明的贻贝黏蛋白的生物制备方法能更高效，成本更低的制备的贻贝粘蛋白，经HPLC‑RPC法检测蛋白纯度，使用C18柱，水—乙腈流动相，测得蛋白纯度90％。

技术领域

本发明涉及黏蛋白制备技术领域，具体地说，本发明涉及一种用于贻贝黏蛋白的生物制备方法。

背景技术

贻贝是海洋养殖业中的重要种类，中国是全球最大的贻贝生产国，占全球年产的1/4。紫贻贝在全球范围内广泛养殖。它的足丝腺分泌贻贝粘蛋白，形成强韧的蛋白丝，使贻贝固定于海水下的任何表面上，耐受风浪的冲击。其海洋来源表现了两个重要特点，一是隔水粘附：在海水中粘附于固体表面；二是耐受海水：形成粘附之后，耐受海水经年的冲刷。

贻贝足丝蛋白的获取方法主要有以下三种手段：

(1)直接从贻贝足腺中提取天然黏附蛋白成分，例如，瑞典Biopolymers公司自20世纪80年代开始直接贻贝足腺中提取并研制成组织培养用的粘合剂产品“Cell-Tak”，该产品主要是Mefp-1、Mefp-2和Mefp-3的混合物，可用于细胞培养过程中非贴壁细胞与培养皿的黏附。但由于贻贝足丝蛋白的分泌量很低，1万个贻贝也只能提取1mg的粘附蛋白，导致这种直接提取的黏合剂产品价格昂贵，美国售价达到115美元/mg。

(2)由于组织提取方法成本高，学者们展开了基因工程手段生产贻贝粘蛋白的研究。如J.H.Waite等在1999年报道了将紫贻贝Mefp-3基因转入酿酒酵母中进行表达[2]；Dong Soo Hwang等于2004年报道了地中海贻贝的Mefp-5在大肠杆菌中的表达，重组的Mefp-5蛋白具有较好的粘结性能，有可能用于医疗及防水黏合剂的开发。韩国浦项工业大学(POSTECH)的Dong Soo Hwang等将地中海贻贝的mfp-5和mfp-3在大肠杆菌中的表达，得到重组的mfp-5和mfp-3蛋白生物化学粘合剂，以用于医疗及防水黏合剂的开发[3]。粘着蛋白原在贻贝足腺细胞中被合成时经历了复杂的糖基化修饰、羟基化修饰及交联反应，而利用基因工程途径所得到的粘着蛋白产物则缺少这种严格而充分的修饰和加工过程。尽管学者们在体外对其进行了部分糖基化修饰，但所添加的寡糖链的数量、羟基化以及交联程度与天然蛋白质相比均相差甚远，致使所得蛋白产物的粘度远远不及天然蛋白质。由于贻贝黏蛋白结构特殊，溶解困难，溶解度低，导致一般的重组表达方案均无法获得理想效果；而少数重组方案又严重依赖昂贵的仪器设备，产率极低，成本高昂，无法满足后续研究和产业化的需求。

(3)由于利用基因工程途径无法获取理想粘度的粘着蛋白产品，因此，贻贝足腺细胞的体外培养与建系研究便成为获取理想粘着蛋白产物的充满希望的开发途径，帮而引起了学术界的广泛关注，早在20年前美国就率先开始了贻贝足腺细胞的体外培养研究，但由于无脊椎动物细胞培养困难，其培养仍属世界性难题，贻贝足腺细胞的传代培养及其建系一直未能成功。

发明内容

本发明的目的是为了克服现有技术的缺陷，提供了一种贻贝黏蛋白的生物制备方法，能更高效，成本更低的制备的贻贝粘蛋白。

为了实现上述目的，本发明提供了一种贻贝黏蛋白的生物制备方法，所述贻贝黏蛋白的生物制备方法包括如下步骤：

(1)克隆：将蛋白序列rMAP-3、rMAP-5分别按照大肠杆菌密码子偏好设计如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2所示的基因序列；将所述基因序列分别克隆至表达载体pET22b(+)中，以得到含有重组蛋白序列的表达载体；