[发明专利]一种贻贝黏蛋白的生物制备方法

权利要求书

1.一种贻贝黏蛋白的生物制备方法，其特征在于，所述贻贝黏蛋白的生物制备方法包括如下步骤：

(1)克隆：将蛋白序列rMAP-3、rMAP-5分别按照大肠杆菌密码子偏好设计如SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2所示的基因序列；将所述基因序列分别克隆至表达载体pET22b(+)中，以得到含有重组蛋白序列的表达载体；

(2)表达：将所述含有重组蛋白序列的表达载体转化表达宿主E.coli BL21(DE3)感受态细胞中，并涂布于LB-Amp平板培养基上，以37℃进行培养；挑取单菌落以LB-Amp平板培养基逐级扩大培养，最终接种于不含Amp的LB培养基中，生长至OD₆₀₀6.0后，加入终浓度1mMIPTG诱导，以37℃表达5hrs，10000rpm离心10min，收集菌体；

(3)纯化：

(3-1)每1克步骤(2)中得到的所述菌体以10-15ml缓冲液A重悬，高压匀浆机破损，10000rpm离心30min，收集得到第一次沉淀；所述缓冲液A为包含以下成分的水溶液：三羟甲基氨基甲烷、谷胱甘肽、和氯化钠；

(3-2)每1克所述第一次沉淀以10-15ml缓冲液B重悬，10000rpm离心30min，收集沉淀，重复一次，得到第二次沉淀；所述缓冲液B为包含以下成分的水溶液：三羟甲基氨基甲烷、谷胱甘肽、氯化钠、和尿素；

(3-3)每1克所述第二次沉淀以10-15ml缓冲液C重悬，10000rpm离心30min，收集沉淀，重复四次，得到第三次沉淀；所述缓冲液C为包含以下成分的水溶液：醋酸、谷胱甘肽、和聚乙二醇辛基苯基醚；

(3-4)每1克所述第三次沉淀以10-15ml缓冲液D重悬，10000rpm离心30min，收集沉淀，重复一次，获得蛋白纯度90％的包涵体；所述缓冲液D为包含以下成分的水溶液：醋酸、谷胱甘肽、和M甘氨酸；

(3-5)每1克所述包涵体以少量纯水重悬，加入12.5ml缓冲液E充分混匀，加入2.5ml缓冲液F混匀，所述包涵体溶解，以纯水定容至100ml，10000rpm离心30min取上清，获得蛋白溶液；所述缓冲液E为包含以下成分的水溶液：醋酸和尿素；所述缓冲液F为包含十二烷基硫酸钠的水溶液；

(4)保存：将步骤(3)中得到的所述蛋白溶液进行过滤除菌，并在10℃下保存。

2.如权利要求1所述的贻贝黏蛋白的生物制备方法，其特征在于，所述缓冲液A为包含以下成分的水溶液：20mM三羟甲基氨基甲烷、20mM谷胱甘肽、和50mM氯化钠；所述缓冲液A的pH为6.0。

3.如权利要求1所述的贻贝黏蛋白的生物制备方法，其特征在于，所述缓冲液B为包含以下成分的水溶液：20mM三羟甲基氨基甲烷、20mM谷胱甘肽、50mM氯化钠、和4M尿素；所述缓冲液B的pH为6.0。

4.如权利要求1所述的贻贝黏蛋白的生物制备方法，其特征在于，所述缓冲液C为包含以下成分的水溶液：20mM醋酸、20mM谷胱甘肽、和1％(g/mL)聚乙二醇辛基苯基醚；所述缓冲液C的pH为5.0。

5.如权利要求1所述的贻贝黏蛋白的生物制备方法，其特征在于，所述缓冲液D为包含以下成分的水溶液：20mM醋酸、20mM谷胱甘肽、和20mM甘氨酸；所述缓冲液D的pH为4.0。

6.如权利要求1所述的贻贝黏蛋白的生物制备方法，其特征在于，所述缓冲液E为包含以下成分的水溶液：80mM醋酸和8M尿素；所述缓冲液E的pH为4.0。

7.如权利要求1所述的贻贝黏蛋白的生物制备方法，其特征在于，所述缓冲液F为包含10％(g/mL)十二烷基硫酸钠的水溶液。

8.如权利要求1所述的贻贝黏蛋白的生物制备方法，其特征在于，步骤(4)中，采用孔径0.22微米的滤膜进行过滤。