[发明专利]用于治疗中枢神经系统损伤的自体脂肪源干细胞的培养方法

权利要求书

1.用于治疗中枢神经系统损伤的自体脂肪源干细胞的培养方法，其特征在于，包括如下步骤：

第一步、脂肪采集，然后在无菌场所采集供者的脂肪，将得到脂肪进行处理，去除血管和纤维部分，然后进行绞碎处理，绞碎处理后用含体积分数0.1-1％庆大霉素的D-Hanks缓冲液冲洗，去除残留血液，得到脂肪组织；

第二步、获取和分离自体脂肪源干细胞：将脂肪组织与所取脂肪组织等体积的0.2％胶原酶磷酸缓冲液消化，在37℃温度条件下均匀震荡消化50-70min，再置于离心机中以1800-2000r/min的转速离心6-10min；将底层细胞用pH值为7.2-7.4的D-Hanks平衡盐液反复吹打，清洗干净；清洗下来的液体经100目筛网过滤，将滤液以1000r/min离心5min，弃去上清液，获得干细胞；

第三步、干细胞培养：将第二步得到的干细胞按1-2×10⁴/cm²接种于培养瓶，加入10mL含体积分数15％胎牛血清的干细胞培养液，置于37℃、CO₂含量为5％的培养箱中培养，4-5天后更换新的含体积分数15％胎牛血清的干细胞培养液，弃去非贴壁细胞，每3-4天更换含体积分数15％胎牛血清的干细胞培养液一次，待细胞生长达到80％融合，在培养瓶中加含体积分数0.25％胰酶-EDTA进行消化；将培养瓶放入37℃孵箱中5min，在倒置显微镜下观察细胞，用手掌轻轻拍打培养瓶确保细胞及组织块完全消化下来，每个培养瓶中加入含体积分数15％胎牛血清的干细胞培养液10mL，反复吹打，将培养瓶中的细胞清洗干净，将清洗下来的细胞悬液移入50mL离心管中，在900-1000r/min的转速条件下离心5min，离心结束后，弃上清，向离心管中加入30mL含体积分数15％胎牛血清的干细胞培养液吹打干净混匀细胞，即得自体脂肪源干细胞。

2.进根据权利要求1所述的用于治疗中枢神经系统损伤的自体脂肪源干细胞的培养方法，其特征在于，干细胞培养液通过如下步骤制备：

将1％L-谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、1％丙酮酸钠、0.01％β-巯基乙醇、0.001％LLIF、0.0001％bFGF、10％FBS和0.001％除菌液用低糖DMEM定容至100mL，用0.22μL的滤器过滤，0℃保存得到干细胞培养液，其中的百分含量均为占配置好的干细胞培养液的体积百分比。

3.用于治疗中枢神经系统损伤的自体脂肪源干细胞的培养方法，其特征在于，除菌液通过如下步骤制备：

将霉素200U、链霉素200U、卡那霉素100μg、制霉菌素15μg和两性霉素B5μg混合，用D-PBS定容至100mL，制得除菌液。