[发明专利]一种(R)-3-氯苯丙醇的酶催化合成方法

说明书

本发明公开了一种(R)‑3‑氯苯丙醇的酶催化合成方法。该方法以3‑氯苯丙酮为底物，以优化后的羰基还原酶为催化剂，生物催化制备(R)‑3‑苯丙醇。本发明酶法制备R构型中间体，操作简便，对环境友好，成本低，副产物少，产物ee值高，实现了托莫西汀手性中间体的高效合成。

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，涉及一种(R)-3-氯苯丙醇的酶催化合成方法。

背景技术

(R)-3-氯苯丙醇是一种可被用于制备盐酸托莫西汀和盐酸达泊西汀的重要手性中间体。CN101012147A中提及一种(R)-3-氯苯丙醇的制备方法，该方法以3-氯苯丙酮与NaBH₄或KBH₄反应，生产(R)-3-氯苯丙醇，其中手性氨基酸衍生物的左旋体包括左旋色氨酸衍生物、左旋异亮氨酸衍生物等，氨基酸衍生物的成本较高，该方法在实际生产应用上，有一定的限制。

CN104496830A中提供了一种盐酸达泊西汀的新合成路线(路线如下)，在该路线中，提及了(R)-3-氯苯丙醇另一种合成方法，该方法通过以3-氯苯丙酮与(-)二异松蒎基氯硼烷在有机相溶剂中，10～80℃下发生反应，得到化合物(R)-3-氯苯丙醇，该方法有机溶剂使用量较大，对环境有一定的污染，且反应条件要求较高，在操作上有一定的难度。

发明内容

本发明的目的是提供一种(R)-3-氯苯丙醇的酶催化合成方法。该方法利用重组羰基还原酶催化进行不对称还原反应制备R构型手性醇。

本发明的目的可以通过以下措施达到：

一种(R)-3-氯苯丙醇的酶催化合成方法，其包括如下步骤：以3-氯苯丙酮为底物，在重组酮羰基还原酶、辅酶/辅酶循环氢供体NADP+/NADPH、辅酶循环酶、助溶剂和缓冲液的存在下，进行生物催化反应生成(R)-3-氯苯丙醇，其中所述重组酮羰基还原酶的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，合成路线如下：

本发明的羰基还原酶基因来源菌株为一株野生酵母菌株，它为光滑假丝酵母Candida glabrata ATCC2001，其核苷酸序列如SEQ ID No.3所示。

本发明的重组酮羰基还原酶是优化后的羰基还原酶，该重组酮羰基还原酶的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，该重组酮羰基还原酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

我们提供了一种本申请所采用的酮羰基还原酶的制备方法，具体为：将核苷酸序列如SEQ ID No.3所示的羰基还原酶经过优化DNA序列后，进行PCR扩增，随后导入羰基还原酶表达载体的HindⅢ和BamHⅠ酶切位点获得重组表达载体，将重组表达载体电转入羰基还原酶表达细胞中，得到酮羰基还原酶表达工程菌，经过抗生素抗性平板涂布筛选后，获得克隆菌株，检测其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示后，对获得的菌株进行活化后发酵培养，离心收集菌体，洗涤并重悬，超声破碎，冻干得到重组酮羰基还原酶。

在重组酮羰基还原酶的制备中，优选的，羰基还原酶表达载体为pRSFDuet-1；羰基还原酶表达细胞为E.coli BL21(DE3)。

本方法中优选的，3-氯苯丙酮与酮羰基还原酶的质量比为1:0.1～1。

本方法中优选的，助溶剂选自异丙醇、DMSO或乙醇。

本方法中优选的，3-氯苯丙酮与助溶剂的质量体积比为1:10～50g：mL。

本方法中优选的，缓冲液为PB缓冲液，其浓度为0.2mM，pH为6.5。

本方法中优选的，辅酶循环酶采用现有技术中的异丙醇脱氢酶、葡糖脱氢酶或甲酸脱氢酶。