[发明专利]一种无异源血清3D培养MSC干细胞制备高活性外泌体的方法

说明书

本发明属于天然生物纳米材料领域，具体涉及一种培养MSC干细胞的HPL培养基及无异源血清3D培养MSC干细胞制备高活性外泌体的方法。本发明提供的培养MSC干细胞的HPL培养基，采用人源性血小板裂解物来代替动物血清FBS用于细胞培养。本发明提供的无异源血清3D培养MSC干细胞制备高活性外泌体的方法，制备工艺简单、高效、成本低；其外泌体产量比常规2D细胞培养方法高得多，所制备外泌体的抗癌活性也更高，且使用更安全，为MSC干细胞来源生物纳米载药治疗癌症等潜在的临床应用铺垫了良好的基础。

技术领域

本发明属于天然生物纳米材料领域，具体涉及一种培养MSC干细胞的HPL培养基及无异源血清3D培养MSC干细胞制备高活性外泌体的方法。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)是一类成体干细胞，可从成人骨髓和脂肪等组织或从新生儿附属组织如脐带和胎盘中分离培养而得。MSC细胞易于体外扩增，天然具有肿瘤趋向性，以及抑制肿瘤生长、消炎和保护机体免受损伤的特点，是一种良好的细胞治疗资源。已发现，MSC展现生物活性的主要机制是通过旁分泌途径向细胞外环境释放一类小的细胞外囊泡(EV)，其直径大小在50～130nm，可向靶细胞传输生物活性分子，诸如蛋白质、活性脂和核酸分子(mRNA、miRNA、lncRNA)，影响或调控靶细胞的功能。根据2018国际EV研究协会指南建议，这类小的EV属于细胞通过内体途径产生的外泌体。越来越多的研究表明，MSC来源的EV具有可媲美于MSC细胞本身的治疗活性，潜在地可用于诸多疾病的治疗，包括癌症、心脑血管病、急性肾损伤、肝脏纤维化和创伤愈合等。所以，现在MSC来源的EV已逐渐成为替代MSC本身的无细胞治疗试剂，被称为细胞治疗的第二代(2G)产品。EV制剂替代MSC用于疾病治疗，具有更好的安全性，可操作性更强，易于保存，还可以多重载药实现联合治疗，以及可以进行靶向修饰、免疫逃逸修饰和药物可控释放修饰，具有非常好的应用前景。

通常采用贴壁方式培养MSC细胞，使用的培养基是添加10～17％FBS的α-MEM或DF12。这种培养细胞的方式，MSC以单细胞层紧贴在培养容器的底部，可称为二维(2D)培养。而在体内环境中，MSC存在的微环境是三维(3D)的，细胞与细胞外基质(如胶原蛋白纤维或透明胶质酸)紧密结合。已有研究发现，体外3D培养的MSC细胞，其分泌某些治疗性因子，如抗癌活性蛋白或消炎因子的水平更高。

众所周知，开发外泌体用于疾病治疗的一个瓶颈就是产量不够高，迫切需要找到提高外泌体产量的方法。已发现低氧培养和饥饿培养等方法可增加MSC细胞的外泌体产量。此外，3D培养环境也有可能增加MSC的外泌体产量。已发现可用于MSC 3D培养的支架材料包括胶原蛋白、壳聚糖、透明质酸和藻元酸钠等。

发明内容

为了克服现有技术的不足和缺点，本发明的首要目的在于提供一种培养MSC干细胞的HPL培养基，该HPL培养基采用人源性血小板裂解物(human platelet lysate，HPL)代替FBS；HPL中含有大量的生长因子，足以支持MSC干细胞的体外生长和扩增，且HPL中含有大量的血纤维蛋白原，在细胞培养过程中可迅速水解为纤维蛋白而形成水凝胶，产生一个3D的培养环境，与含有FBS的培养基相比，该HPL培养基不仅能更好地支持细胞生长和体外扩增，而且HPL含有的血纤维蛋白形成的水凝胶3D环境显著增加了MSC外泌体的产量，且EV携带的TRAIL的表达水平也显著增加，其抗癌效应相应得到增强。

本发明的另一目的在于提供一种无异源血清3D培养MSC干细胞制备高活性外泌体的方法，该方法利用上述HPL培养基，通过3D培养TRAIL基因工程修饰的MSC干细胞(MSCflT)，制得的表达TRAIL的外泌体(EV-T)的产量和抗癌蛋白TRAIL的表达水平均显著高于2D培养来源的EV-T，并且EV-T的生物活性也更高，具有更好的治疗潜力。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种培养MSC干细胞的HPL培养基，包含人源血小板裂解物(HPL)和基础DF-12培养基；其中，人源血小板裂解物(HPL)的含量为5％(v/v)；