[发明专利]一种无异源血清3D培养MSC干细胞制备高活性外泌体的方法

权利要求书

1.一种无异源血清3D培养MSC干细胞制备高活性外泌体的方法，其特征在于包含如下步骤：

（1）将人源血小板裂解物和基础培养基混合，得到培养MSC干细胞的HPL培养基，其中，人源血小板裂解物的含量为5%v/v；

（2）将表达TRAIL的病毒转染MSC干细胞，得到TRAIL基因工程化的MSC干细胞即MSCflT；

（3）采用步骤（1）制得的培养MSC干细胞的HPL培养基对MSCflT进行3D培养，然后分离外泌体；

所述的人源血小板裂解物的制备方法，包含如下步骤：

将人源血小板进行冷冻、解冻处理，并重复操作一次；然后1500g离心10min，收集上清，得到人源血小板裂解液；将血小板裂解液在4℃条件下10000g离心10min，收集上清并过滤，得到人源血小板裂解物；

步骤（2）中所述的MSC干细胞为脐带来源间充质干细胞。

2.根据权利要求1所述的无异源血清3D培养MSC干细胞制备高活性外泌体的方法，其特征在于：

步骤（2）中所述的病毒包括但不限于慢病毒、逆转录病毒和腺病毒。

3.根据权利要求1所述的无异源血清3D培养MSC干细胞制备高活性外泌体的方法，其特征在于：

步骤（2）中所述的表达TRAIL的病毒，通过如下方法制备得到：

将TRAIL表达质粒pCCL-CMV-flT与慢病毒包装质粒pCMV-dR8.74 和 pMD2.G共转染293T细胞，收集细胞培养上清，通过超速离心沉淀病毒，最后将病毒沉淀重新悬浮溶解于PBS溶液，得到表达TRAIL的慢病毒溶液。

4.根据权利要求3所述的无异源血清3D培养MSC干细胞制备高活性外泌体的方法，其特征在于：

步骤（2）中所述的转染的具体操作为：

采用表达TRAIL的慢病毒溶液转染MSC干细胞，并采用终浓度为8μg/mL的polybrene增强转染，孵育 6~24 h；孵育后将培养基换成含有10% FBS的DF12新鲜培养基，继续培养 2~3天；待细胞长满后，进行增殖传代培养，得到TRAIL 基因工程化的MSC干细胞。

5.根据权利要求1所述的无异源血清3D培养MSC干细胞制备高活性外泌体的方法，其特征在于：

步骤（3）中所述的分离方法包括但不限于超速离心、外泌体沉淀试剂沉淀、密度梯度离心、超滤离心、PEG-base沉淀法和大小排阻色谱法中的至少一种。

6.一种高活性外泌体，其特征在于通过1~5任一项所述的制备方法制备得到。

7.权利要求6所述的高活性外泌体在制备抗癌产品中的应用。