[发明专利]重组DpnI限制性内切酶的制备方法

说明书

本发明提供了一种重组DpnI限制性内切酶的制备方法，包括以下步骤：步骤一、合成DpnI的编码基因，构建至原核表达载体，获得重组载体：DpnI的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，经添加终止密码子和密码子优化得到DpnI的编码基因的核苷酸序列；步骤二、将重组载体转入甲基化酶缺失的大肠杆菌感受态细胞中，获得重组菌；步骤三、将通过PCR及测序鉴定重组菌中的目的片段的序列正确性；步骤四、将带有正确目的片段的单克隆进行DpnI限制性内切酶表达；步骤五、DpnI限制性内切酶的纯化。相较于之前文献的特殊菌种的DE3溶源化表达方法，本发明方法所用菌株材料无需特殊处理，操作流程简化，成功率高。

技术领域

本发明属于分子生物学和细胞工程领域，具体涉及一种重组DpnI限制性内切酶的制备方法。

背景技术

DpnI是肺炎双球菌(Diplococcus pneumoniae)体内的一种限制性内切酶，其特点在于DpnI只有在其识别位点被甲基化时才切割(见图1)。GATC序列广泛的存在于各种物种基因组上，DpnI是遗传及基因工程上，实用性较高的限制酶种类。因常用的克隆及表达菌种包括DH5a，Top10，BL21(DE3)，BL21(DE3 plyS)等均含有内源性甲基化酶，导致表达载体及宿主菌基因组被甲基化，并且广泛的存在DpnI识别位点，引起DpnI对宿主基因组及表达质粒的切割，使用常规T7启动子为载体的DpnI构建，虽然能够正常的在DH5a或Top10等菌种中正常克隆，但在例如BL21(DE3)等的表达菌种中的基底蛋白表达会严重抑制宿主菌的正常增殖及表达载体的复制，使蛋白无法正常表达。

发明内容

为了克服现有技术的上述缺陷，本发明提供了一种DpnI限制性内切酶的制备方法。首先基因合成DpnI蛋白编码序列，后通过重组或连接方式将基因构建至以大肠杆菌自身RNA聚合酶所能识别的启动子(tac,lacUV,trc等)为异源基因表达启动子的载体上。将扩大的连接或重组分子克隆反应体系产物直接转化至JM110(甲基化酶缺失)菌种中(不使用DH5a或Top10为中间宿主)，鉴定生长出的单克隆，挑取测序正确的单克隆直接进行DpnI的表达。经过亲和，凝胶色谱层析得到高纯度蛋白。

具体的技术方案为：一种重组DpnI限制性内切酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤一、合成DpnI的编码基因，构建至原核表达载体，获得重组载体：DpnI的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示或者相似度在95％及以上的相似编码氨基酸序列，经添加终止密码子和密码子优化得到DpnI的编码基因的核苷酸序列；步骤二、将重组载体转入甲基化酶缺失的大肠杆菌感受态细胞中，获得重组菌；步骤三、将通过PCR及测序鉴定重组菌中的目的片段的序列正确性；步骤四、将带有正确目的片段的单克隆进行DpnI限制性内切酶表达；步骤五、DpnI限制性内切酶的纯化。

进一步地，原核表达载体为大肠杆菌自身聚合酶可识别启动子tac、lacUV或trc的载体；DpnI的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

进一步地，原核表达载体为pGEX-6p-1载体；甲基化酶缺失的大肠杆菌为JM110。

进一步地，步骤一具体为：使用高保真酶扩增DpnI编码基因，同时以BamHI、SalI限制性内切酶，双酶切pGEX-6p-1载体后，通过同源重组方式插入至pGEX-6p-1；确保读码框正确，以GST蛋白为纯化标签。

进一步地，步骤二中采用200-400μl JM110感受态细胞与40-80μl重组反应体系获得的重组反应产物混合转入重组载体，获得重组菌；

40-80μl重组反应体系包含：200-400ng pGEX-6p-1载体、50-100ng DpnI编码基因、2-4μl Exnase重组酶和8-16μl 5X缓冲液。