[发明专利]重组DpnI限制性内切酶的制备方法

权利要求书

1.一种重组DpnI限制性内切酶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、合成DpnI的编码基因，构建至原核表达载体，获得重组载体：所述DpnI的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，经添加终止密码子和密码子优化得到所述DpnI的编码基因的核苷酸序列；所述原核表达载体为pGEX-6p-1载体；

所述步骤一具体为：使用高保真酶扩增DpnI编码基因，同时以BamHI、SalI限制性内切酶，双酶切pGEX-6p-1载体后，通过同源重组方式插入至pGEX-6p-1；确保读码框正确，以GST蛋白为纯化标签；

步骤二、将所述重组载体转入甲基化酶缺失的大肠杆菌感受态细胞中，获得重组菌；所述甲基化酶缺失的大肠杆菌为JM110；

所述步骤二中采用200-400 µl JM110感受态细胞与40 -80 µl 重组反应体系获得的重组反应产物混合转入所述重组载体，获得所述重组菌；

所述40 -80 µl 重组反应体系包含：200-400 ng pGEX-6p-1载体、50-100 ng DpnI编码基因、2-4 µl Exnase重组酶和8-16 µl 5X缓冲液；

所述步骤二具体为：将200-400 µl JM110感受态细胞-80℃取出后于冰上放置10 min，后加入重组反应产物，缓慢吹打混匀，于冰上放置15 min，后于42℃水浴锅中热激45s，取出在冰上放置10 min，后加入1 ml LB培养基于37℃摇床 220 rpm 培养1 hr；最后10000g离心去上清，菌体于氨苄抗性LB平板上涂布均匀；重组反应产物是所述40 -80 µl 重组反应体系在37℃下反应25 min所获得的产物；

步骤三、将通过PCR及测序鉴定所述重组菌中的目的片段的序列正确性；

所述步骤三具体为：挑取单克隆菌株于2.5 ml试管中，220 rpm 37℃，培养10 hr，进行菌液PCR，使用载体多克隆位点两端的通用测序引物进行PCR反应；将PCR鉴定正确的单克隆菌株送检测序，比对确定序列正确的克隆菌株；所述步骤四具体为：挑取单克隆接种至10ml载体相应抗性的LB培养基中，于过夜摇床培养，次日接种于1L双抗的LB摇瓶中，220rpm 37℃，摇床培养至OD 0.6-0.8，加入终浓度0.5 mM的IPTG进行诱导，表达21小时；

步骤四、将带有正确目的片段的单克隆进行DpnI限制性内切酶表达；

步骤五、DpnI限制性内切酶的纯化；

所述步骤五具体为：10000 rcf离心力离心5 min收集菌体，去除上清培养基，使用预冷的含100mM KCl、25 mM Tris pH7.5缓冲液30 ml悬浮菌体，后使用高压650 bar进行破菌5min，破菌同时加入蛋白酶抑制剂后，14000 rcf离心30 min去除沉淀，上清加入相应的亲和纯化介质进行结合，之后进行特意位点蛋白酶介导的在柱标签切割或不经切割直接洗脱，将洗脱蛋白进行以AKTA介导的洗脱分离过程，进行凝胶色谱层析，确定获得的重组DpnI限制性内切酶的纯度；

步骤六、DpnI限制性内切酶的酶活的测定。