[发明专利]具备表面展示苯丙氨酸解氨酶的工程益生菌在审

专利信息
申请号: 202110017460.5 申请日: 2021-01-07
公开(公告)号: CN112662607A 公开(公告)日: 2021-04-16
发明(设计)人: 蒋宇 申请(专利权)人: 上海陶宇晟生物技术有限责任公司
主分类号: C12N1/21 分类号: C12N1/21;C12N15/70;C12N15/90;C12N15/60;C12N15/55;C12N15/31;A61K35/741;A61K38/51;A61P3/00;C12R1/19
代理公司: 上海申浩律师事务所 31280 代理人: 贾师英
地址: 201201 上海*** 国省代码: 上海;31
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摘要:
搜索关键词: 具备 表面 展示 苯丙氨酸 解氨酶 工程 益生菌
【说明书】:

本发明公开了一种具备表面展示苯丙氨酸解氨酶的工程益生菌,其为大肠杆菌Nissle 1917衍生菌,在基因组上敲除了基因argR和/或发生了基因argA(Y19C)突变,整合了L‑苯丙氨酸解氨酶基因stlA、L‑苯丙氨酸内运蛋白基因pheP、L‑氨基酸脱氨酶基因pma、外排泵基因acrA。该工程益生菌能够用于治疗苯丙酮尿症。

技术领域

本发明属于基因工程领域,具体地说,涉及一种具备表面展示苯丙氨酸解氨酶的工程益生菌、其构建方法及其在制备苯丙酮尿症治疗药物中的应用。

背景技术

苯丙酮尿症(phenylketonuria,PKU)是一种先天性的苯丙氨酸代谢障碍疾病,是一种常染色体隐性遗传病。在中国,PKU在新生儿中的发病率大概在1/11000,已被列为新生儿必查的疾病项目。

苯丙酮尿症是因肝脏苯丙氨酸羟化酶(phenylalanine hydroxylase,PAH)缺乏或四氢生物喋呤合成酶、二氢生物喋呤还原酶突变导致。正常情况下,苯丙氨酸经PAH催化生成酪氨酸,然后通过酪氨酸代谢途径合成甲状腺、肾上腺和黑色素等。PAH突变,导致苯丙氨酸在肝脏中出现代谢紊乱,无法转化为酪氨酸,而是苯丙氨酸与α-酮戊二酸在血液与组织中堆积并被排泄到尿液中,另外,其代谢产物在中枢神经中蓄积会产生毒性,从而诱发患儿出现兴奋不安、多动和精神异常等。

目前对PKU的治疗方法主要是食疗法。苯丙氨酸作为人体必需氨基酸之一,主要从食物中获取,对于PKU患儿不能无苯丙氨酸饮食,所以为了保证机体的正常生长发育,需要对PKU患儿采取低苯丙氨酸饮食,但食疗存在长期坚持困难和经济负担重等问题。随着分子生物学技术的发展,基因治疗已进入了实验阶段,例如,将携带表达PAH基因的cDNA重组腺病毒置于小鼠体内,以恢复肝脏PAH活性,但目前主要存在转运效率低的问题。

发明内容

益生菌是一大类药物,一般通过口服活菌制剂达到治疗疾病和康复保健效果。益生菌药物制剂的优点在于给药方便,口感较好,病人乐于接受,顺从性高,而且能够持续地在肠道内增殖从而稳定地发挥治疗作用。

大肠杆菌属E.coli Nissle 1917(简写为EcN或者Nissle 1917)是一种非致病性大肠杆菌,也是一种益生菌。申请人在发明专利CN202011457369.7中报道了一种可用于治疗苯丙酮尿症的Nissle 1917工程益生菌对苯丙氨酸的降解能力,增强其治疗苯丙酮尿症的效果。发明人继续利用基因工程技术来改造Nissle 1917工程益生菌,使其具备表面展示苯丙氨酸解氨酶,进一步提高其降解苯丙氨酸的能力。具体而言,本发明包括如下技术方案:

一种工程益生菌,其为大肠杆菌Nissle 1917衍生菌,其具备表面展示的苯丙氨酸解氨酶(L-phenylalanine ammonia-lyase,PAL)。

上述的工程益生菌是以大肠杆菌Nissle 1917为底盘菌,通过质粒表达或者基因组整合构建出表面展示L-苯丙氨酸解氨酶PAL的大肠杆菌Nissle 1917工程益生菌;或者是以胞内已具备苯丙氨酸解氨酶PAL的大肠杆菌Nissle 1917工程菌为基础,再进行表面展示苯丙氨酸解氨酶PAL的基因工程改造而得到的Nissle 1917工程益生菌。

例如,以大肠杆菌Nissle 1917为底盘菌,通过质粒表达或者基因组整合构建出表面展示L-苯丙氨酸解氨酶基因stlA的大肠杆菌Nissle 1917工程益生菌。所述质粒例如可以是pINP-stlA质粒,转化入Nissle 1917(EcN)后,得到重组工程益生菌EcN/pINP-stlA。

上述的胞内已具备苯丙氨酸解氨酶PAL的大肠杆菌Nissle 1917工程菌可以通过下述步骤构建得到:在大肠杆菌Nissle 1917基因组上整合了外源L-苯丙氨酸解氨酶基因stlA、外源L-苯丙氨酸内运蛋白基因pheP和外源L-氨基酸脱氨酶基因pma。

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