[发明专利]具备表面展示苯丙氨酸解氨酶的工程益生菌

权利要求书

1.一种工程益生菌，其为大肠杆菌Nissle 1917衍生菌，其特征在于，具备表面展示的L-苯丙氨酸解氨酶。

2.如权利要求1所述的工程益生菌，其特征在于，以大肠杆菌Nissle 1917为底盘菌，通过质粒表达或者基因组整合而得到；或者

以胞内已具备苯丙氨酸解氨酶的大肠杆菌Nissle 1917工程菌为基础，再进行表面展示苯丙氨酸解氨酶的基因工程改造而得到。

3.如权利要求2所述的工程益生菌，其特征在于，所述胞内已具备苯丙氨酸解氨酶的大肠杆菌Nissle 1917工程菌通过下述步骤构建得到：在大肠杆菌Nissle 1917基因组上整合了外源L-苯丙氨酸解氨酶基因stlA、外源L-苯丙氨酸内运蛋白基因pheP和外源L-氨基酸脱氨酶基因pma。

4.如权利要求3所述的工程益生菌，其特征在于，还整合了内源的外排泵基因acrA；

并且/或者敲除了基因argR和/或发生了基因argA(Y19C)突变；

并且/或者对stlA、pheP、acrA基因的RBS序列进行优化。

5.如权利要求4所述的工程益生菌，其特征在于，所述L-苯丙氨酸解氨酶基因stlA的核苷酸序列是SEQ ID NO:1；所述L-苯丙氨酸内运蛋白基因pheP的核苷酸序列是SEQ ID NO:2；所述L-氨基酸脱氨酶基因是pma的核苷酸序列是SEQ ID NO:3；所述外排泵基因acrA的核苷酸序列是SEQ ID NO:4。

6.如权利要求4所述的工程益生菌，其特征在于，stlA基因的RBS序列变化为SEQ IDNO:5；pheP基因的RBS序列变化为SEQ ID NO:6；acrA基因的RBS序列变化为SEQ ID NO:7。

7.如权利要求1所述的工程益生菌，其特征在于，菌株的基因型是：EcN(malP::Pj23119H-stlA,yicS::Pj23119H-stlA,malE::Pj23119H-stlA,rthC::Ptac-stlA,exo::Ptac-stlA,lacZ::Pj23119H-pheP,agaI::Pj23119H-pheP,araBD::Para-pma,dapA::inaK-stlA,argA*,△argR,lacZ::Pj23119H-acrA)。

8.一种构建如权利要求1-7中任一项所述工程益生菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：

A.以含表面展示stlA质粒pINP-stlA的工程益生菌EcN/pINP-stlA为底盘菌，分别在基因组的malP位点、yicS位点、malE位点、rhtC位点和exo位点中的一个以上位点敲入L-苯丙氨酸解氨酶基因stlA，获得stlA基因整合菌株；

B.对于步骤A中获得的stlA基因整合菌株，在其基因组的lacZ位点和agaI位点中的一个以上位点敲入L-苯丙氨酸内运蛋白基因pheP，得到stlA+pheP整合菌株；

C.对于步骤B中获得的stlA+pheP整合菌株，在其基因组的araBD位点敲入L-氨基酸脱氨酶基因pma，得到stlA+pheP+pma整合菌株；

D.对于步骤C中获得的stlA+pheP+pma整合菌株，敲除其基因组中的二氢吡啶二羧酸合酶基因dapA，得到stlA+pheP+pma△dapA菌株；

E.对于步骤D中获得的stlA+pheP+pma△dapA菌株，对其基因组的argA位点进行(Y19C)突变，得到stlA+pheP+pma△dapA argA*菌株；

F.对于步骤E中获得的stlA+pheP+pma△dapA argA*菌株，敲除其基因组中的argR，得到stlA+pheP+pma△dapA argA*△argR菌株。