[发明专利]用于序列特异性蛋白酶检测的分子开关

说明书

本发明公开了用于序列特异性蛋白酶检测的分子开关，属于蛋白检测领域。本发明的分子开关包括依次用接头连接的HiBiT突变体、LgBiT和SmBiT；HiBiT突变体和LgBiT之间的接头含有识别切割序列。前述HiBiT突变体对LgBiT具有高度亲和力，但其与LgBiT结合状态下无荧光素酶功能，因此所述分子开关可以在未接触蛋白酶时无荧光素酶活性，但接触蛋白酶时，HiBiT突变体脱离，LgBiT结合SmBiT产生荧光素酶活性，可通过发光底物检测。本发明的分子开关可提高检测信噪比，具有比现有分子开关更强的检测灵敏度。

技术领域

本发明属于蛋白检测领域。

背景技术

序列特异性蛋白酶能特异性识别和切割特定的氨基酸序列，在细胞生理、病理过程中有重要作用，在基因工程中也有广泛应用。比如，烟草蚀斑病毒蛋白酶(Tobacco etchvirus protease,TEVp)和半胱氨酸依赖性天冬氨酸蛋白酶(caspases)就是典型的序列特异性蛋白酶。

TEVp是基因工程中常用的工具酶，具有很强的位点特异性，其特异性识别序列为E-Xaa-Xaa-Y-Xaa-Q-G/S，其中ENLYFQG是最常用的识别序列，切割位点在最后两个氨基酸之间。TEVp通常被用于体内、体外切割融合蛋白中的标签蛋白和目的蛋白，还可用于监测蛋白质之间的相互作用、检测蛋白的结构和功能、用于原核细胞核糖体开关的监测及生化反应的体外检测等等。

caspases是细胞凋亡等过程中的信号分子和效应分子。当细胞受到诸如DNA损伤、癌基因表达等刺激后，即可触发内源性或外源性凋亡通路。这些通路中的上游分子如caspase-8，caspase-9等首先被激活，进而导致下游的效应分子caspase-3和其他分子的激活。这些激活的效应分子，切割其底物分子，再通过一系列级联反应导致凋亡。众多疾病，如肿瘤、炎症、感染等，都与caspases有着密切关系，因此caspases长期是生物医学研究中的重要目标分子。

序列特异性蛋白酶的检测可以用免疫识别相关的检测手段，例如Western Blot、酶联免疫吸附试验、放射免疫吸附试验等蛋白通用检测手段，但通用检测手段不能检测酶活，因此，又产生了比色法、荧光共振能量转移法、双光子纳米探针等等方法，均是利用蛋白酶的特异性识别位点对模拟肽进行切割，使其产生可检测的荧光(颜色)变化。但这些方法均存在信噪比低的问题。

Nanoluc荧光素酶是从一种深海虾类动物中分离到的荧光素酶，经过改造和优化后，具有迄今最强的发光活性(96孔板测量值可达10⁸)，同时发光持续时间长，分子量小，这些特点十分有利于其在生物医学中的应用。此外，Dixon等2015年的研究发现，Nanoluc羧基末端长度为11个氨基酸(AA)的片段，可以与氨基末端的大片段(商品名LgBiT)分离开来。他们将这11AA片段进一步改造和进化，得到两个新的多肽，商品名称分别为SmBiT和HiBiT(Promega)。HiBiT与LgBiT之间具有高亲和力(Kd＝0.7nM)，而SmBiT与LgBiT之间的亲和力很低(Kd＝190μM)，当HiBiT或SmBiT与LgBiT分离时，各部分均没有酶活性，而当这两部分靠近时，则恢复Nanoluc活性。

Triana等为了研究2个目标蛋白是否相互作用，将2个目标蛋白分别融合到SmBiT和LgBiT，当荧光素酶活性被激活时，表明这2个目标蛋白存在相互作用关系。Boursier等将HiBiT与G蛋白偶联受体(GPCR)融合表达于细胞膜，借此可检测膜表面受体密度；他们还利用了GPCR配体与荧光标志物都竞争性结合HiBiT-GPCR融合蛋白，以评估配体浓度。

目前，尚未见将Nanoluc荧光素酶的不同片段用于检测序列特异性蛋白酶的报道。

发明内容

本发明要解决的问题是：使用Nanoluc荧光素酶的不同片段来提高序列特异性蛋白酶检测的信噪比。

本发明的技术方案如下：