[发明专利]基于小麦钾转运蛋白基因的功能标记开发方法

权利要求书

1.基于小麦钾转运蛋白基因的功能标记开发方法，其特征在于：包括以下操作步骤：

S1.提取小麦基因组DNA；

S2.对小麦基因组DNA用限制性内切酶进行酶切，得到小麦钾转运蛋白基因HAK1序列，

HAK1序列对：上链：TTGGATCCAGAAGGGGTGAAC，

下链：ACAAGATAGGTCGCATACTGG；

S3. 对小麦钾转运蛋白基因HAK1的5′端进行处理，对PCR扩增引物对进行染色标记，然后对小麦钾转运蛋白基因HAK1进行PCR扩增，获得PCR扩增产物，

PCR扩增引物对：上链：TGGAAGCGGAACGGATGAGGA，

下链：CTGCGGGAACGAGGGAGTGTC；

S4.对PCR扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，染色后在紫外线下观察小麦钾转运蛋白基因HAK1。

2.根据权利要求1所述的基于小麦钾转运蛋白基因的功能标记开发方法，其特征在于：所述步骤S1包括以下操作步骤：

a.称取0.1-0.3g的小麦籽粒于预冷的研钵中，加入2-3倍体积(W/V，约300-500μl) 提取缓冲液，在冰盘上研磨，研碎后转入一EP管中；

b.再加约300-500μl提取缓冲液，加入20％SDS至终浓度为2％，约 60-70μl，轻轻混匀后于60-70℃水浴，10-15min，加入1/10体积的5mol/L醋酸钾(约60-70μl)，于水浴中反应20-40min，离心（10-20krpm,10-20min,3-5℃）；

c.取上相转入一新的EP管中，用等体积的酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）抽提一次（上下晃动几次即可），离心（10-20krpm,10-20min,15-25℃）；

d.取上相转入一新的EP管中，加入等体积的异丙醇，于室温下反应5-10min，其间将管至少颠倒5-7次，离心（10-20krpm,10-20min,3-5℃）；

e.弃上清液，用70％乙醇冲洗沉淀物，真空抽干或吹干，最后溶于1×TE中（约40-60μl），提取出小麦基因组DNA。

3.根据权利要求1所述的基于小麦钾转运蛋白基因的功能标记开发方法，其特征在于：所述琼脂糖凝胶电泳的浓度为0.5～2%，电泳时电场强度为5-20V/cm，电泳温度为20-40℃，所述琼脂糖凝胶电泳采用的核酸染色剂是溴化乙锭。

4.根据权利要求1所述的基于小麦钾转运蛋白基因的功能标记开发方法，其特征在于：所述PCR扩增变形的温度为93-95℃，持续1-3min，所述PCR扩增退火的温度为50-65℃，持续20-40s，所述PCR扩增延伸的温度为70-80℃，持续20-40s。