[发明专利]抗草鱼pIgR多克隆抗体的制备方法及其应用

说明书

本发明涉及一种抗草鱼pIgR多克隆抗体的制备方法及其应用。本发明抗草鱼pIgR的制备方法，包括如下步骤：构建pIgR表达载体pET28a(+)‑pIgR；将构建的重组质粒pET28a(+)‑pIgR转入大肠杆菌菌株，使用IPTG诱导表达草鱼pIgR。本发明还涉及一种所述抗草鱼pIgR多克隆抗体的应用。本发明为研究草鱼pIgR蛋白的结构、来源、功能及与免疫球蛋白的关系中的应用提供了重要工具，为草鱼pIgR在黏膜免疫防御的过程中起到的作用研究提供了重要的技术手段。

技术领域

本发明涉及一种多克隆抗体的制备方法及其应用，具体讲是一种抗草鱼(Paralichthys olivaceus)多聚免疫球蛋白受体重组蛋白的多克隆抗体制备方法及其应用，属于鱼类分子免疫学技术领域。

背景技术

在哺乳动物中，多聚免疫球蛋白受体pIgR能够与分泌型多聚免疫球蛋白(IgA或IgM)形成复合物，pIgR经蛋白酶裂解切割后为分泌成分，从而形成分泌型免疫球蛋白阻止病毒、细菌、毒素和外来异物对黏膜组织的黏附和入侵。因此，pIgR的有效分泌是IgA或IgM发挥黏膜防御功能的必要条件。

鱼类虽然是低等脊椎动物，但它仍有与高等脊椎动物类似的较为完善的免疫系统。研究表明硬骨鱼的皮肤及肠道和哺乳动物的肠道采用同样的免疫球蛋白转运系统，即能够通过上皮细胞中的pIgR转运四聚体免疫球蛋白进入黏液而发挥其免疫功能。制备抗草鱼多聚免疫球蛋白受体的多克隆抗体，可以为阐明多聚免疫球蛋白受体的结构、来源、功能以及与免疫球蛋白的关系等提供有力工具；另外，鱼类感染某种病原或接种疫苗后，鱼体会产生pIgR与免疫球蛋白复合物即分泌型免疫球蛋白(SIgs)。因此，利用抗草鱼多聚免疫球蛋白受体的多克隆抗体，通过检测草鱼黏液中多聚免疫球蛋白受体的产生，可以进行草鱼疾病的早期诊断和疫苗使用效果的评价，对草鱼疾病的预防及治疗具有重要理论和现实意义，对其他养殖鱼类疾病的防治具有参考价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种抗草鱼pIgR多克隆抗体的制备方法；本发明的另一个目的是提供一种抗草鱼pIgR多克隆抗体的应用。

本发明的目的是由以下技术方案实现的：

一种所述抗草鱼pIgR的制备方法，包括如下步骤：构建pIgR表达载体pET28a(+)-pIgR；将构建的重组质粒pET28a(+)-pIgR转入大肠杆菌菌株，使用IPTG诱导表达草鱼pIgR。优化表达条件通过变复性的方式重溶目标蛋白，Ni柱亲和纯化获得目的蛋白。以制备的草鱼pIgR蛋白作为抗原免疫新西兰白兔，经过3-4次免疫之后，经免疫学检测筛选方法，筛选出特异性分泌抗草鱼pIgR多克隆抗体。

所述的构建pIgR表达载体，是设计全长拼接引物获得草鱼pIgR基因，经EcoRV及XhoI双酶切后连接pET28a(+)。

所述的免疫学检测筛选方法是间接酶联免疫法和转印免疫印迹法；其中所述的间接酶联免疫法是将制备的免疫兔血清与纯化的草鱼pIgR蛋白于96孔酶标板中反应；继而加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔抗体；450nm工作波长测定各孔光吸收值，筛选抗草鱼pIgR蛋白的多克隆抗体。所述的转印免疫印迹法是将制备的抗草鱼pIgR蛋白的多克隆抗体与转移至硝酸纤维素膜的草鱼pIgR蛋白反应，确定该多抗的抗原决定簇是分子量为27.64kDa的草鱼pIgR蛋白。

一种所述抗草鱼pIgR多克隆抗体的应用，包括如下步骤：利用ELISA分析灭活柱状黄杆菌免疫草鱼后pIgR及SIgs免疫应答规律，弄清pIgR表达与SIgs免疫应答关系；转印免疫印迹法检测并分析草鱼血清及黏液中的plgR；用免疫组织化学染色法定位草鱼pIgR在系统及黏膜组织中的分布。

所述的ELISA是将收集免疫后的草鱼皮肤黏液、鳃黏液、肠黏液及胆汁包被至96孔板，多克隆抗体孵育；继而加入HRP标记的羊抗兔抗体；分析免疫后各分泌液中pIgR(SC)蛋白水平变化。