[发明专利]抗草鱼pIgR多克隆抗体的制备方法及其应用

权利要求书

1.一种抗草鱼pIgR多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：构建pIgR表达载体pET28a(+)-pIgR；将构建的重组质粒pET28a(+)-pIgR转入大肠杆菌菌株，使用IPTG诱导表达草鱼pIgR。

2.权利要求1所述的所述抗草鱼pIgR多克隆抗体的制备方法，其特征在于：优化表达条件通过变复性的方式重溶目标蛋白，Ni柱亲和纯化获得目的蛋白。

3.权利要求1所述的所述抗草鱼pIgR多克隆抗体的制备方法，其特征在于：以制备的草鱼pIgR蛋白作为抗原免疫新西兰白兔，经过3-4次免疫之后，经免疫学检测筛选方法，筛选出特异性分泌抗草鱼pIgR多克隆抗体。

4.根据权利要求1所述的所述抗草鱼pIgR多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述的构建pIgR表达载体，是设计全长拼接引物获得草鱼pIgR基因，经EcoRV及XhoI双酶切后连接pET28a(+)。

5.根据权利要求3所述的所述抗草鱼pIgR多克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述的免疫学检测筛选方法是间接酶联免疫法和转印免疫印迹法；其中所述的间接酶联免疫法是将制备的免疫兔血清与纯化的草鱼pIgR蛋白于96孔酶标板中反应；继而加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗兔抗体；450nm工作波长测定各孔光吸收值，筛选抗草鱼pIgR蛋白的多克隆抗体。所述的转印免疫印迹法是将制备的抗草鱼pIgR蛋白的多克隆抗体与转移至硝酸纤维素膜的草鱼pIgR蛋白反应，确定该多抗的抗原决定簇是分子量为27.64kDa的草鱼pIgR蛋白。

6.一种抗草鱼pIgR多克隆抗体的应用，包括如下步骤：利用ELISA分析灭活柱状黄杆菌免疫草鱼后pIgR及SIgs免疫应答规律，弄清pIgR表达与SIgs免疫应答关系；转印免疫印迹法检测并分析草鱼血清及黏液中的plgR；用免疫组织化学染色法定位草鱼pIgR在系统及黏膜组织中的分布。

7.根据权利要求6所述的抗草鱼pIgR多克隆抗体的应用，其特征在于：所述的ELISA是将收集免疫后的草鱼皮肤黏液、鳃黏液、肠黏液及胆汁包被至96孔板，多克隆抗体孵育；继而加入HRP标记的羊抗兔抗体；分析免疫后各分泌液中pIgR(SC)蛋白水平变化。

8.根据权利要求6所述的抗草鱼pIgR多克隆抗体的应用，其特征在于：所述的转印免疫印迹法是将草鱼皮肤黏液、鳃黏液、肠黏液及血清电泳后转移至PVDF膜，多克隆抗体孵育PVDF膜；继而加入HRP标记的羊抗兔抗体；检测多克隆抗体可以特异性结合黏液中天然存在的草鱼pIgR。

9.根据权利要求6所述的抗草鱼pIgR多克隆抗体的应用，其特征在于：所述的免疫组织化学染色法是将多克隆抗体与草鱼黏膜组织石蜡切片反应；继而加入HRP标记的羊抗兔抗体；检测多克隆抗体可以特异性结合黏液细胞膜表面的抗原决定簇。