[发明专利]一种基于DNA-PAINT的细胞膜上PD-L1蛋白检测方法及序列

说明书

本发明公开了一种基于DNA‑PAINT的细胞膜上PD‑L1蛋白检测方法及序列，利用设计的DNA锚链和DNA成像链，通过细胞固定、抗体偶联、孵育，采用全内反射照明模式进行DNA‑PAINT成像，用于检测乳腺癌细胞表面上PD‑L1蛋白。利用DNA‑PAINT超分辨技术不受荧光淬灭影响，空间分辨率高等优点，检测到了MB‑231细胞和MCF‑7细胞上PD‑L1蛋白在膜上的分布，为乳腺癌的免疫治疗提供一定的帮助。

技术领域

本发明涉及单分子定位与荧光免疫染色的领域，特别涉及一种基于DNA-PAINT的细胞膜上PD-L1蛋白检测方法及序列。

背景技术

在全球范围内，乳腺癌是女性中最常见的癌症，仅2018年就确诊了210万例乳腺癌病例。目前，使用检查点抑制剂的免疫疗法正在作为一种新的乳腺癌治疗手段出现。在乳腺癌的免疫治疗中，PD-L1蛋白是重要的免疫检查点分子。乳腺癌细胞会过表达PD-L1蛋白，它与T细胞上的PD-1蛋白结合，从而抑制T细胞的免疫功能，实现癌细胞的免疫逃逸。免疫治疗是利用免疫检查点抗体阻断癌细胞上免疫检查点，从而增加T细胞效应，延长细胞耐受性，达到清除肿瘤细胞的目的。

为了更好的了解癌细胞的免疫检查点蛋白，利用超分辨光学成像技术(DNA-PAINT)对乳腺癌细胞表面的PD-L1蛋白进行精确的空间定位和定量分析。DNA-PAINT通过两条互补DNA链(即锚链和成像链)之间的瞬时相互作用来实现对多个目标的顺序检测。在DNA-PAINT中，染料标记的成像链(8-10nt)瞬时与锚链结合。成像链和锚链之间的瞬时杂交和解离分别代表荧光的开启和关闭状态。通过全内反射荧光(TIRF)显微镜检测荧光的开和关，从而产生“闪烁”事件。通过采集多张荧光闪烁的图片进行超分辨图像的重建可达到约25nm的空间分辨率。对于目标区域，DNA探针之间的结合率与目标分子的浓度成正比。可以进一步调整这种可编程的结合动力学(即闪烁频率和持续时间)以定量分析分布在衍射极限以下区域内的密集堆积靶标，这被称为定量PAINT(或qPAINT)。

利用DNA-PAINT的高分辨率有望在单分子层面上，对乳腺癌细胞表面的蛋白进行空间的定位分析和定量分析，从而更加准确的表征乳腺癌细胞的生物标志物，为将来更好的免疫治疗乳腺癌提供支持。

发明内容

本发明为了更加准确的检测乳腺癌细胞表面的PD-L1蛋白，提供了一种基于DNA-PAINT的细胞膜上PD-L1蛋白检测方法及序列，可用于对乳腺癌细胞表面的PD-L1蛋白进行空间的定位分析和定量分析，以更好的指导肿瘤免疫治疗的发展。

作为本方面的一个方面，本发明的技术方案：一种基于DNA-PAINT的细胞膜上PD-L1蛋白检测方法，其包括以下步骤，(1)将PD-L1抗体与DBCO-sulfo-NHS进行偶联、孵育、提纯；，得到DBCO-sulfo-NHS偶联的抗体；(2)将DNA锚链与所述DBCO-sulfo-NHS偶联的抗体进行共孵育，提纯后获得DNA偶联的抗体，所述DNA锚链的序列如SEQ NO.1所示；(3)将所述DNA偶联的抗体加入预处理的细胞中进行孵育，之后进行冲洗，冲洗结束后加入DNA成像链并孵育，进行DNA-PAINT超分辨成像，所述DNA成像链的序列如SEQ NO.2所示。

优选的，步骤(1)中，所述将PD-L1抗体与DBCO-sulfo-NHS进行偶联、孵育、提纯，其为将1μL 0.443mg/mL的PD-L1抗体和8μL 100mM的DBCO-sulfo-NHS加到400μL的PBS溶液中，铝箔包裹后放入摇床中孵育2小时，设置孵育温度为4℃，所述提纯，其为将孵育后的溶液离心，然后加入PBS溶液重悬提纯的溶液中，以同样的参数再次离心。

优选的，步骤(2)中，所述将DNA锚链与所述DBCO-sulfo-NHS偶联的抗体进行共孵育，其为用铝箔包裹放入摇床中在室温下孵育90min。

优选的，步骤(3)中，所述预处理的细胞包括MCF-7细胞、MB-231细胞的一种或几种，所述将所述DNA偶联的抗体加入预处理的细胞中进行孵育的条件为4℃环境下孵育12小时以上。