[发明专利]用于获得CAR-NK细胞的方法

说明书

本发明涉及制造用病毒载体遗传修饰的自然杀伤(NK)细胞的领域，这些病毒载体携带编码嵌合抗原受体(CAR)的多核苷酸。本发明进一步涉及用方法获得的CAR‑NK细胞，和这些CAR‑NK细胞在医学中、特别是用于在治疗癌症的方法中的用途。

本发明涉及遗传修饰的自然杀伤(NK)细胞及其制造方法的领域。具体地，本发明涉及CAR-NK细胞、制造这些CAR-NK细胞的方法、和这些CAR-NK细胞在医学中、特别是用于治疗癌症中的用途。

自然杀伤细胞(NK细胞)是具有抗肿瘤、抗病毒和抗微生物活性的先天性免疫细胞。在报道了NK细胞在患有癌症的患者中的成功过继性转移和体内扩增后，将NK细胞用于治疗癌症引起了关注[Ruggeri等人(2005)CurrOpin Immunol[免疫学当前观点]17:211-7；Ren等人(2007)Cancer BiotherRadiopharm[癌症生物治疗和放射药物]22:223-34；Koehl等人(2004)Blood Cells Mol Dis[血细胞分子和疾病]33:261-6.176；Passweg等人(2004)Leukemia[白血病]18:1835-8]。通常，在这些研究中，供体NK细胞输注的耐受性良好且没有诱导GvHD的证据。然而，迄今为止，在患有癌症的患者中，只进行了少数研究过继性NK细胞输注的试验。主要障碍是仅相对少量NK细胞可以从常规白细胞去除术产物分离。这妨碍了患有癌症的人中NK细胞剂量依赖性抗肿瘤应答的临床试验[Klingemann等人(2004)Cytotherapy[细胞疗法]6:15-22；Passweg等人(2006)Best Pract Res Clin Haematol[临床血液学最佳实践和研究]19:811-824；McKenna等人(2007)Transfusion[输液]47:520-528；Koehl等人(2005)KlinPadiatr[小儿科杂志]217:345-350；Iyengar等人(2003)Cytotherapy[细胞疗法]5:479-484；Meyer-Monard等人(2009)Transfusion[输液]49:362-371]。因此，正在研究的用于扩增和激活NK细胞的离体方案，使得能够实现更高NK细胞剂量的临床试验，并且允许多次NK细胞输注[Carlens等人(2001)Hum Immunol[人类免疫学]62:1092-1098；Barkholt等人(2009)Immunotherapy[免疫疗法]1:753-764；Berg等人(2009)Cytotherapy[细胞疗法]11:341-355；Fujisaki等人(2009)Cancer Res[癌症研究]69:4010-4017；Siegler等人(2010)Cytotherapy[细胞疗法]12(6):750-63]。然而，大多数方案通过使用支持性饲养细胞系来面对技术缺点，这些支持性饲养细胞系对于大规模和多中心试验而言可能导致产生NK细胞产物的调控问题。先前，我们已经描述了具有以高细胞数目、高纯度和功能性从CD34+造血干细胞产生临床相关的NK细胞产物的能力的替代性基于细胞因子的培养方法[Spanholtz等人(2010)PLoS One[公共科学图书馆综合]5:e9221]。我们已经进一步优化了CD34+干细胞的富集，并且开发了导致高产率激活的CD34+干细胞来源的NK细胞的可扩展程序。

嵌合抗原受体(CAR)是包含三个基本单元的杂交分子：(1)细胞外抗原结合基序，(2)连接/跨膜基序，和(3)细胞内T细胞信号传导基序(Long等人(2013)Oncoimmunology 2[肿瘤免疫学2](4):e23621)。

通常，CAR的抗原结合基序与单链可变片段(scFv)，即免疫球蛋白(Ig)分子的最小结合域是可比的。替代性抗原结合基序，例如，受体配体、完整免疫受体、文库衍生肽、和先天性免疫系统效应分子(例如，NKG2D)也已被工程化。用于CAR表达的替代性细胞靶标(例如，NK或γ-δT细胞)也在开发中(Brown等人(2012)Clin Cancer Res[临床癌症研究]18(8):2199-209；Lehner等人(2012)PLoS One[公共科学图书馆综合]7(2):e31210)。