[发明专利]用于获得CAR-NK细胞的方法

权利要求书

1.一种用于制造用嵌合抗原受体(CAR)遗传修饰的细胞的群体的方法，该方法包括：

(i)第一步骤，包括：

a)提供包含CD34+造血干细胞的样品，

b)纯化所述样品中的CD34+造血干细胞，

c)在培养基I的存在下，培养这些纯化的CD34+造血干细胞，

d)通过在培养基I中在包含所述多核苷酸的载体存在下培养这些细胞群体至少10小时，优选地至少16小时、更优选地至少24小时、更优选地至少36小时、更优选地至少48小时、更优选地至少60小时、最优选地至少72小时，用编码CAR的多核苷酸转导这些纯化的CD34+造血干细胞，由此获得包含表达所述CAR的CD34+干细胞的细胞群体，并且

e)在培养基I中培养这些细胞群体至少10小时、优选至少16小时、更优选至少24小时、更优选至少36小时、更优选至少48小时、更优选至少60小时、最优选至少72小时，其中

培养基I是包含细胞因子的集合的基本培养基，其中所述细胞因子的集合包含白介素-7，和干细胞因子(SCF)、flt-3配体(FLT-3L)、血小板生成素(TPO)中的一种或多种，以及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和白介素-6(IL-6)中的两种或更多种。

2.根据权利要求1所述的方法，其中步骤c)中的细胞培养以在500与10,000个CD34⁺细胞/ml之间、更优选地在1,000与8,000个CD34+细胞/ml之间、更优选地在2,000与6,000个CD34+细胞/ml之间的细胞密度开始。

3.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中该多核苷酸不编码对造血干细胞、自然杀伤(NK)祖细胞或NK细胞上表达的抗原特异的CAR。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，该方法进一步包括:

(ii)第二步骤，其中，来自步骤(i)的细胞群体被扩增并分化成含有CAR-NK祖细胞和/或CAR-NK细胞的细胞群体，该步骤包括在培养基III中培养来自步骤(i)的含有CAR-CD34+干细胞的细胞群体，由此获得含有CAR-NK祖细胞和/或CAR-NK细胞的细胞群体，其中该培养基III是包含细胞因子的集合的基本培养基，其中所述细胞因子的集合包含SCF、IL-7、IL-15和白介素-2(IL-2)中的两种或更多种，以及GM-CSF、G-CSF、和IL-6中的两种或更多种。

5.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，该方法进一步包括:

(ii)第二步骤，其中，来自步骤(i)的细胞群体被扩增并分化成含有CAR干细胞和/或CAR祖细胞的细胞群体，该步骤包括在培养基II中培养来自步骤(i)的CAR-CD34+干细胞，由此获得含有CAR干细胞和CAR祖细胞的细胞群体，以及

(iii)第三步骤，其中，来自步骤(ii)的细胞群体被进一步扩增并分化成含有CAR-NK祖细胞和/或CAR-NK细胞的细胞群体，

其中培养基II是包含细胞因子的集合的基本培养基，其中所述细胞因子的集合包含SCF、FLT-3L白介素-15(IL-15)和IL-7中的两种或更多种，以及GM-CSF、G-CSF、和IL6中的两种或更多种，并且

其中培养基III是包含细胞因子的集合的基本培养基，其中所述细胞因子的集合包含SCF、IL-7、IL-15和白介素-2(IL-2)中的两种或更多种，以及GM-CSF、G-CSF、和IL-6中的两种或更多种。

6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法，其中该样品已从脐带血获得。

7.根据权利要求1-6中任一项所述的方法，其中使用CD34+免疫磁性选择方法纯化干细胞。