[发明专利]无标记N-聚糖定量方法

说明书

本公开文本提供了一种用于在不使用标记如荧光标记的情况下检测和定量N‑聚糖和N‑连接糖基化谱的新颖无标记的N‑聚糖分析方法。该方法允许减少样品制备和色谱分离时间，并且可用于产物批量释放。

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年11月21日提交的美国临时申请号62/938,803的优先权益，所述申请通过引用以其整体并入本文。

对经由EFS-WEB电子提交的序列表的引用

与本申请一起提交的ASCII文本文件(名称：3338_190PC01_SL_ST25.txt；大小：14,351字节；以及创建日期：2019年11月20日)中电子提交的序列表的内容通过引用以其整体并入本文。

背景技术

糖基化通常在糖缀合物(例如糖蛋白)的一种或多种生物学功能中起重要作用。例如，糖蛋白的糖基化模式可以影响其正确折叠的能力、其稳定性(例如，对蛋白水解和/或其他降解的抗性)、催化活性、药效学和/或药代动力学特性、和/或该糖蛋白与其他分子适当相互作用的能力。可替代地或另外地，糖蛋白的糖基化模式可以影响糖蛋白的转运和靶向，例如，决定糖蛋白是否保持在细胞内(包括例如将糖蛋白正确靶向适当的一个或多个亚细胞区室)、糖蛋白是否将是膜结合的和/或糖蛋白是否将从细胞中分泌。

单克隆抗体和其他蛋白质是复合糖蛋白，其被开发用于治疗各种适应证，例如癌症和自身免疫疾病。具体而言，单克隆抗体通常在重链的保守天冬酰胺残基处被糖基化。聚糖在控制单克隆抗体治疗剂的功能和功效方面是重要的，并且因此通常被要求作为用于人类的释放测试的关键质量属性组的一部分。根据末端糖残基，“N-连接聚糖”或“N-聚糖”分为复合型、高甘露糖型和杂合型N-聚糖。

传统上，在变性和用PNGase F进行酶促消化后，N-连接聚糖从糖蛋白中释放，然后荧光标记(如用2-氨基苯甲酰胺)释放的聚糖。然后使用利用荧光检测的亲水相互作用液相色谱(HILIC)分离标记的聚糖，以生成存在于抗体样品中的聚糖的色谱图。尽管使用了数十年，但使用有毒试剂和延长的样品制备时间，该方法仍然是麻烦的。因此，需要有效地定量蛋白质的糖基化谱。

发明内容

本公开文本涉及一种定量重组蛋白的糖基化谱的方法，其包括在没有任何标记的情况下分析所述一种或多种N-连接聚糖，其中所述N-连接聚糖在分析之前通过酶促消化从所述重组蛋白释放。本公开文本还涉及一种定量重组蛋白的糖基化谱的方法，其包括在没有任何荧光团的情况下分析所述一种或多种N-连接聚糖，其中这些N-连接聚糖在分析之前通过酶促消化从所述重组蛋白释放。在一些方面，所述重组蛋白纯度为至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％。在一些方面，所述分析包括在包括柱的色谱法期间分离一种或多种N-连接聚糖。在一些方面，所述柱是混合模式柱。在一些方面，使用一种或多种流动相进行所述分离。在一些方面，所述柱是混合模式多孔石墨碳(PGC)柱。在一些方面，所述酶包括肽N-糖苷酶F(PNGaseF)。在一些方面，将所述酶与所述重组蛋白一起孵育，其中所述一种或多种N-连接聚糖在所述分离之前从所述重组蛋白释放。在一些方面，在缓冲液中稀释所述酶。在一些方面，分离的所述一种或多种N-连接聚糖通过质谱仪、ELSD、NQAD或折射率检测器测量。在一些方面，分离的所述一种或多种N-连接聚糖通过电雾式检测器(CAD)来测量。

在一些方面，所述色谱法包括第一流动相和第二流动相，其中所述第一流动相和所述第二流动相是不同的。在一些方面，所述第一流动相包含水。在一些方面，所述第二流动相包含乙腈。在一些方面，所述第一流动相包含甲酸(FA)、三氟乙酸(TFA)、三乙胺(TEA)或其任何组合。在一些方面，所述第一流动相包含0.1％FA。在一些方面，所述第一流动相包含0.1％TEA。在一些方面，所述第二流动相包含甲酸(FA)、三氟乙酸(TFA)、三乙胺(TEA)或其任何组合。在一些方面，所述第二流动相包含0.1％FA。在一些方面，所述第二流动相包含0.1％TEA。在一些方面，所述分离在低于70℃的温度下进行。