[发明专利]用于将多核苷酸递送至外泌体中的核酸构建体

说明书

本发明使用在miRNA分子MIR21、pri‑miR‑21和pre‑miR‑21中鉴定的结构和调控特性将外源核苷酸序列递送至外泌体中。特别地，本发明涉及用于将外源核苷酸序列靶向到外泌体的pre‑miRNA，其中pre‑miRNA包含外源核苷酸序列和茎环结构，其中茎包含至少一个摆动对。本发明还提供包含工程化的pre‑miRNA的核酸盒、载体和细胞、装载外泌体的方法和所得装载的外泌体。装载的外泌体能够用于将外源核苷酸序列递送至靶细胞，例如在疗法中。

技术领域

本发明涉及能够将核苷酸序列递送至外泌体中的核酸构建体，以及使用这些构建体产生包含感兴趣的核苷酸序列的外泌体的方法。

背景技术

外泌体是起源于内体区室的膜结合囊泡，并且当多囊体(MVB)与质膜融合时从细胞中分泌出来。外泌体的直径典型地在30和120nm之间。外泌体可含有许多类型的生物分子，包括蛋白、碳水化合物、脂质和核酸。外泌体生物发生涉及胆固醇、神经酰胺和其它脂质在膜上的富集，这些脂质典型地存在于抗去污剂的细胞膜中。蛋白也嵌入外泌体膜中，诸如跨膜四蛋白和其它跨膜蛋白和受体，它们可在它们的分选和生物活性中发挥作用(Colombo等人，2014年)。

外泌体的内腔含有特定的蛋白和核酸，诸如microRNA(miRNA)，它们赋予外泌体调制靶细胞中转录和翻译的能力。外泌体内的miRNA库似乎反映生产细胞的生理状态，选择的miRNA穿梭到外泌体中。还观察到外泌体包裹或外泌体相关联的miRNA的分泌在影响产生它们的细胞的旁分泌活动中发挥作用。这种机制可使细胞在正常条件下和对局部刺激(诸如感染、营养缺乏或缺氧)的反应中均进行局部和远程控制。

将外源货物分子诸如感兴趣的miRNA装载到外泌体中被认为是利用它们在细胞间递送信号的能力的有用方法。一种方法是将感兴趣的生物分子直接引入收获的外泌体。然而，尽管使用诸如电穿孔和脂质体转染的技术在小规模上可能实现这一点，但这些技术尚未被证明在大规模上是可重复的、可扩展的或可靠的。此外，这些技术甚至可损害外泌体的结构(Janas等人，2015年)。

已经证明miRNA被细胞选择性地穿梭到外泌体中。约60％的miRNA编码序列位于基因内或基因间区，并且因此表达取决于调控一级基因表达的调控序列和转录因子。然而，较小比例的miRNA编码区位于基因间区，并且含有它们自己的启动子序列、增强子和阻遏子。因此，这些miRNA的表达取决于附加的调控水平，以细胞依赖性和刺激依赖性的方式特异性地控制它们的正确表达，这种方式依赖于由其它基因管控的启动子介导的激活。在这两种情况下，miRNA最初被转录嵌入称为pri-miRNA(“一级miRNA”)的长前体内，其中功能性miRNA被含有酶Drosha的蛋白复合物对其有效和正确加工和切割所必需的序列围绕。Drosha在细胞核中的正确加工形成被称为pre-miRNA的较短前体。这种pre-miRNA典型地形成茎环结构，然后从细胞核转运到细胞质，在细胞质中它被蛋白复合物RISC识别，RISC包括RNase DICER和Argonaute(Ago)蛋白。Dicer切割pre-miRNA结构的环部分以形成成熟双链miRNA，其中一条链(称为过客链)可能被Ago降解或丢弃，在RISC内留下单链指导链。然后，RISC复合物能够沉默包含与单链miRNA指导链互补的序列的信使RNA的基因表达。pre-miRNA中发夹的长度和环的大小被认为对于DICER的正确切割和指导miRNA链的定位均是至关重要的(Tsutsumi等人，2011年)。

目前，尚不清楚穿梭到外泌体中的miRNA如何在产生外泌体的细胞中逃避RISC的细胞质加工。Ago蛋白一般不位于外泌体中，这表明将miRNA分选为外泌体的特定机制。已经证明，将miRNA向上穿梭到外泌体中需要pre-miRNA或成熟miRNA与一组不同的RNA结合蛋白(RBP)相互作用，这些RNA结合蛋白对MVB形成期间位于内质膜中的神经酰胺具有高亲和力(Villarroya-Beltrei等人，2013年)。然而，不同的细胞和microRNA组合报告不同的RBP作为伴侣。关于哪一种RBP负责miRNA选择性穿梭到外泌体中，似乎没有达成共识，而且似乎在细胞之间采用不同的RBP。