[发明专利]用于荚膜多糖聚核糖基-核糖醇-磷酸(PRP)的生产、回收和纯化的方法及其用途

说明书

本发明涉及包括生产和纯化由细菌b型流感嗜血杆菌(Hib)产生的荚膜多糖聚核糖基核糖醇磷酸(PRP)的方法，以获得具有合适分子质量和纯度的多糖，用于随后配制Hib结合疫苗。本发明还涉及荚膜多糖聚核糖基核糖醇磷酸(PRP)在制备疫苗中的用途。

发明领域

本发明涉及一种用于由细菌b型流感嗜血杆菌(Hib)所产生的荚膜多糖聚核糖基-核糖醇-磷酸(phosphate)(PRP)的生产和纯化的方法。更具体地，本发明涉及一种具有适用于随后配制Hib结合疫苗的纯度和分子量的多糖(PRP)的纯化方法。

发明背景

流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae)是革兰氏阴性、需氧/微需氧细菌，具有球杆菌(cocobacillary)形态，是不动性的，不形成孢子，其存在于75％的健康儿童和成人的鼻咽中，因此构成无症状携带者。没有在任何其他动物物种中检测到该微生物的记录(ADA和ISAACS，2003；KELLY等人，2004)。

它在1890年被Pfeiffer在流感大流行期间分离，被误认为是流感的原因。流感嗜血杆菌(H.influenzae)在1890年的大流行和随后的许多其他大流行中可能是流感病毒(流感)的重要继发性侵入物(PITTMAN，1931)。

由于它们是需要复杂营养的生物，嗜血杆菌(Haemophilus)属(“血液朋友”)需要血红素的前体用于生长，其存在于血液中，特别是因子X(即，氯化血红素)和因子V(NAD或NADP)(HARRISON等人，2008)，其是负责生长的因子。该细菌在35℃与37℃之间更好地生长，其中最佳pH是约7.6。在实验室中，它在需氧条件下生长，具有低CO₂张力(5％CO₂)，尽管它能够使用硝酸盐作为最终电子受体制备糖酵解途径和呼吸链。

1995年，流感嗜血杆菌是第一个基因组被完全测序的生物，并且所产生的遗传信息示出了关于毒力因子和疫苗靶标的重要特征，以及关于该微生物的不同代谢途径的知识(ALI等人，2002)。

一部分无症状携带者(对应于3％至7％)可以携带流感嗜血杆菌的致病变体，其在细菌的传播中非常重要。五岁之下的儿童，老年人和免疫抑制个体受这种感染的影响最大，其包括脑膜炎、肺炎、会厌炎、败血症等(KELLY等人，2004)。

该细菌物种可以具有称为荚膜的外部结构。根据组成其的多糖的组成，其被分类为六种不同的血清型(a、b、c、d、e、f)。未封帽的这种细菌物种被分类为不可分型的(KELLY等人，2004)。

在由嗜血杆菌产生的感染之中，95％是由具有b型多糖荚膜的细菌引起的。b型流感嗜血杆菌感染的发病机制并不完全清楚，尽管b型多糖荚膜或聚核糖基-核糖醇-磷酸(PRP)的存在被认为是主要的毒力因子，其由含有核糖、核糖醇和磷酸的单元的单体组成(图1)(CRISEL等人，1975)。

荚膜结构具有抗吞噬特性并且不能诱导补体旁路途径，允许细菌侵入血流和脑脊液，而不吸引吞噬细胞或引起炎症响应和补体介导的裂解。出于该原因，促进吞噬作用和细菌裂解两者的针对荚膜的抗体是针对由b型流感嗜血杆菌引起的感染的免疫防御的主要因素(ADA和ISAACS，2003；ST.GEME和CUTTER，1996)。

预防由b型流感嗜血杆菌引起的疾病的有效途径(尤其是在五岁之下的儿童之中)是通过1999年在巴西实施的公共疫苗接种计划(KMETZSCH等人，2003)。此种策略产生积极影响，降低发病率和死亡率(MIRANZI等人，2006)。

使用由细菌荚膜构成的疫苗仅能够诱导强的初次抗体应答，但具有小的免疫记忆诱导。为了避免该不期望的特征，结合疫苗出现了，其中Hib PRP被化学结合至选择的蛋白质以改变抗原呈递的类型和诱导的免疫应答的类型，从而保证T-依赖型的免疫记忆应答，其在具有最高风险的年龄组中是有效的(KELLY等人，2004)。