[发明专利]临床和工业规模的完整组织测序

说明书

本发明提供了用于对完整组织内细胞中的靶核酸进行原位基因测序的设备、方法和系统。本发明还提供了筛选候选药剂以确定所述候选药剂能否调控完整组织内细胞中核酸的基因表达的方法。

关于联邦政府赞助的研究或开发的声明

本发明专利获得了政府的支持，其中，美国国防高级研究计划局的资助项目为W911NF-14-2-0013，美国国立卫生研究院的资助项目为DA042012和MH075957。政府拥有本发明的某些权利。

背景技术

生物样品含有跨越单个细胞和整个组织长度尺度的复杂异构遗传信息。细胞内核酸的空间模式可以揭示细胞功能特性和异常；RNA表达的累积分布可以定义细胞类型或功能；组织内细胞类型所处位置的系统性变化可以定义组织功能。在核酸中编码的解剖连接信息与整个组织的细胞类型分布的组合可能涉及许多组织切片。因此，原位核酸测序技术必须能够跨分辨率，小至单个分子、大至整个大脑。在不同数量级的长度差异下有效地收集和记录这些信息需要新的发明来增强原位测序技术的稳健性、迅捷性、自动化和高通量性质。

发明内容

本发明提供了用于对完整组织内细胞中的靶核酸进行原位基因测序的设备、方法和系统。本发明还提供了筛选候选药剂以确定所述候选药剂能否调控完整组织内细胞中核酸的基因表达的方法。

在一方面，提供了用于对完整组织内细胞中的靶核酸进行原位基因测序的方法，所述方法包含：(a)在允许发生特异性杂交的条件下，使固定透化完整组织样品与至少一对寡核苷酸接触，其中所述寡核苷酸对包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸；其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸各自包含第一互补性区域、第二互补性区域和第三互补性区域；其中所述第二寡核苷酸进一步包含条形码序列；其中所述第一寡核苷酸的第一互补性区域与所述靶核酸的第一部分互补，其中所述第一寡核苷酸的第二互补性区域与所述第二寡核苷酸的第一互补性区域互补，其中所述第一寡核苷酸的第三互补性区域与所述第二寡核苷酸的第三互补性区域互补，其中所述第二寡核苷酸的第二互补性区域与所述靶核酸的第二部分互补，而且其中所述第一寡核苷酸的第一互补性区域与所述第二寡核苷酸的第二互补性区域相邻；(b)加入连接酶以连接所述第二寡核苷酸的5′端和3′端，生成封闭的核酸环；(c)在进行滚环扩增之前，将所述组织样品与DNA聚合酶一起预孵育足够长的时间，以使所述DNA聚合酶在整个组织样品中均匀扩散；(d)通过使所述组织样品与脱氧核苷三磷酸接触从而生成一个或更多个扩增子来进行滚环扩增，其中所述连接的第二寡核苷酸用作模板，所述第一寡核苷酸用作所述DNA聚合酶的引物；(e)在步骤(a)-(d)中任何一项执行之前或之后，将所述组织样品包埋入水凝胶中；(f)将所述一个或更多个扩增子与所述水凝胶交联；(g)使所述水凝胶透明化，以提高水凝胶透明度；(h)使具有所述条形码序列的所述一个或更多个水凝胶包埋的扩增子与读码引物和荧光标记的探针接触，其中所述探针包含寡核苷酸，所述寡核苷酸包含通过二硫键与荧光团(其包含第二硫醇基团)共价连接的第一硫醇基团，所述二硫键位于所述第一硫醇基与所述第二硫醇基之间；(i)连接所述读码引物与所述荧光标记的探针，其中仅在所述读码引物和所述荧光标记的探针与所述同一扩增子的相邻序列互补时，方发生所述连接；(j)使所述水凝胶与包含抗氧化剂的抗褪色缓冲液接触；(k)对所述一个或更多个水凝胶包埋的扩增子进行成像，以确定正在进行原应基因测序的所述靶核酸在所述完整组织内细胞中的定位，其中在抗褪色缓冲液存在的情况下进行成像；(l)使所述水凝胶与还原剂接触，从而还原所述二硫键，并将所述荧光团从所述探针上裂解下来；(m)去除所述水凝胶中的所述荧光团；以及(n)重复步骤(h)-(m)。

在某些实施例中，所述方法进一步包含将所述完整组织进行切片，并将所述完整组织的切片平放在表面上。例如，可将金属环压在所述切片上，并使用所述金属环将所述切片平坦地转移至所述表面上。在一些实施例中，对所述组织进行冷冻切片。

在另一方面，提供了用于自动实施本文所述的方法的流体系统，从而允许连续操作。在一些实施例中，所述系统包括流体设备、被配置成实施本文所述的方法的处理器。