[发明专利]临床和工业规模的完整组织测序

权利要求书

1.一种用于对完整组织内细胞中的靶核酸进行原位基因测序的方法，所述方法包含：

(a)在允许发生特异性杂交的条件下，使固定透化完整组织样品与至少一对寡核苷酸接触，

其中所述寡核苷酸对包含第一寡核苷酸和第二寡核苷酸；

其中所述第一寡核苷酸和所述第二寡核苷酸各自包含第一互补性区域、第二互补性区域和第三互补性区域；其中所述第二寡核苷酸进一步包含条形码序列；

其中所述第一寡核苷酸的第一互补性区域与所述靶核酸的第一部分互补，其中所述第一寡核苷酸的第二互补性区域与所述第二寡核苷酸的第一互补性区域互补，其中所述第一寡核苷酸的第三互补性区域与所述第二寡核苷酸的第三互补性区域互补，其中所述第二寡核苷酸的第二互补性区域与所述靶核酸的第二部分互补，而且其中所述第一寡核苷酸的第一互补性区域与所述第二寡核苷酸的第二互补性区域相邻；

(b)加入连接酶以连接所述第二寡核苷酸的5′端和3′端，生成封闭的核酸环；

(c)在进行滚环扩增之前，将所述组织样品与DNA聚合酶一起预孵育足够长的时间，以使所述DNA聚合酶在整个组织样品中均匀扩散；

(d)通过使所述组织样品与脱氧核苷三磷酸接触从而生成一个或更多个扩增子来进行滚环扩增，其中所述连接的第二寡核苷酸用作模板，所述第一寡核苷酸用作所述DNA聚合酶的引物；

(e)在步骤(a)-(d)中任何一项执行之前或之后，将所述组织样品包埋入水凝胶中；

(f)将所述一个或更多个扩增子与所述水凝胶交联；

(g)使所述水凝胶透明化，以提高水凝胶透明度；

(h)使具有所述条形码序列的所述一个或更多个水凝胶包埋的扩增子与读码引物和荧光标记的探针接触，其中所述探针包含寡核苷酸，所述寡核苷酸包含通过二硫键与荧光团(其包含第二硫醇基团)共价连接的第一硫醇基团，所述二硫键位于所述第一硫醇基与所述第二硫醇基之间；

(i)连接所述读码引物与所述荧光标记的探针，其中仅在所述读码引物和所述荧光标记的探针与所述同一扩增子的相邻序列互补时，方发生所述连接；

(j)使所述水凝胶与包含抗氧化剂的抗褪色缓冲液接触；

(k)对所述一个或更多个水凝胶包埋的扩增子进行成像，以确定正在进行原位基因测序的所述靶核酸在所述完整组织内细胞中的定位，其中在抗褪色缓冲液存在的情况下进行成像；

(l)使所述水凝胶与还原剂接触，从而还原所述二硫键，并将所述荧光团从所述探针上裂解下来；

(m)去除所述水凝胶中的所述荧光团；以及

(n)重复步骤(h)-(m)。

2.根据权利要求0所述的方法，其中所述抗氧化剂是没食子酸正丙酯。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中在步骤(a)执行之前，先使所述组织样品的内源性RNA附着于所述水凝胶上。

4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中在步骤(a)-(d)中任何一项执行之前或之后使所述水凝胶透明化。

5.根据权利要求0-4中任一项所述的方法，其中所述细胞存在于细胞群中。

6.根据权利要求5所述的方法，其中所述细胞群包含多种细胞类型。

7.根据权利要求0-6中任一项所述的方法，其中所述靶核酸是RNA或DNA。

8.根据权利要求7所述的方法，其中所述RNA是mRNA。

9.根据权利要求0-8中任一项所述的方法，其中所述第二寡核苷酸包含挂锁探针。

10.根据权利要求0-9中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸的第一互补性区域的长度为19-25个核甘酸。

11.根据权利要求0-10中任一项所述的方法，其中所述第一寡核苷酸的第二互补性区域的长度为6个核甘酸。