[发明专利]噬菌体环化测定

说明书

本发明涉及一种用于确定在遗传展示系统上展示的肽配体的环化程度的方法，其中所述肽配体包含在两个或多个氨基酸残基处与分子支架共价连接的多肽，其包括步骤：将所述遗传展示系统上展示的多肽暴露至所述分子支架，其中所述多肽在所述两个或多个氨基酸残基处包含两个或多个肽反应性基团，其与分子支架在两个或多个支架反应性基团处形成共价键以得到所述肽配体；从所述遗传展示系统中去除未反应的分子支架；将所述遗传展示系统上展示的所述肽配体暴露于第一探针，其中第一探针与肽配体上的第一未偶联的反应性基团结合；以及测量所述肽配体上的第一未偶联的反应性基团。

背景技术

环肽能够以高亲和力和靶标特异性与蛋白质靶标结合，因此是用于治疗剂开发的有吸引力的分子类别。实际上，数个环肽已经成功用于临床，例如，抗菌肽万古霉素，免疫抑制药物环孢霉素或抗癌药物奥曲肽(ocreotide)(Driggers等人，Nat Rev Drug Discov2008，7(7)，608-24)。良好的结合特性是由于肽与靶标之间形成的相对较大的相互作用表面以及环状结构的构象(conformational)柔韧性降低所致。通常，大环结合数百平方埃的表面，例如，环肽CXCR4拮抗剂CVX15(Wu,B.等人，Science 330(6007)，1066-71)，结合整联蛋白αVb3的具有Arg-Gly-Asp基序的环肽(Xiong,J.P.等人，Science2002，296(5565)，151-5)、或结合尿激酶型纤溶酶原激活物的环肽抑制剂upain-1(Zhao,G.等人，J Struct Biol 2007,160(1),1-10)。

由于其环状构型，肽大环比线性肽柔韧性差，导致与靶标结合后熵损失较小，并导致更高的结合亲和力。与线性肽相比，降低的柔韧性还导致锁定靶标特异性构象，增加了结合特异性。该效果已经被基质金属蛋白酶8(MMP-8)有效的选择性抑制剂例证了，其中当所述抑制剂的环打开时，失去了对其他MMP的选择性(Cherney,R.J.等人，J Med Chem 1998，41(11)，1749-51)。通过大环化实现的有利的结合特性，甚至在具有一个以上肽环的多环肽中更显著，例如，在万古霉素、乳酸链球菌肽(nisin)或放线菌素中。

之前不同的研究小组将带有半胱氨酸残基的多肽连接至合成的分子结构上(Kemp,D.S和McNamara,P.E.，J.Org.Chem,1985；Timmerman,P等人，ChemBioChem，2005)。Meloen和合作者使用三(溴甲基)苯和相关分子将多个肽环快速且定量地环化至合成的支架上，用于蛋白表面的结构化模拟(Timmerman,P.等人，ChemBioChem，2005)。WO 2004/077062、WO 2006/078161和WO 2018/197893中公开了用于生成候选药物化合物的方法，其中所述化合物是通过将包含半胱氨酸的多肽连接到分子支架上而生成的，所述分子支架例如为三(溴甲基)苯。

WO 2004/077062公开了选择候选药物化合物的方法。具体地，该文献公开了包含第一和第二反应性基团的多种支架分子，并且使所述支架与其他分子接触以在偶联反应中在支架和其他分子之间形成至少两个键。

WO 2006/078161公开了结合化合物、免疫原性化合物和模拟肽。该文献公开了从现有蛋白中提取的各种肽集合的人工合成。然后将这些肽与具有一些引入的氨基酸变化的恒定合成肽组合，以产生组合文库。通过由化学键将这种多样性引入来区分以各种氨基酸改变为特征的肽，为发现期望的结合活性提供了增加的机会。该文献的附图1显示了各种环肽构建体的合成的示意图。该文献中公开的构建体依赖-SH功能化肽，典型地包含半胱氨酸残基，和支架上的杂芳基，典型地包含苄基卤取代基如二-或三-溴苯基苯。此类基团反应以在肽和支架之间形成硫醚键。