[发明专利]制备双索引甲基化序列文库的方法

说明书

本发明涉及用于产生甲基化序列NGS文库以用于全基因组测序或靶向再测序的方法和组合物。另外，本发明涉及用于确定靶核酸的甲基化谱的方法和组合物。

相关申请的交叉引用

本申请要求2019年9月30日提交的美国临时专利申请号62/907,778的优先权，该申请的内容通过引用整体并入本文中。

技术领域

本发明涉及用于确定双链DNA分子的序列以及用于鉴定和分析双链DNA分子中甲基化胞嘧啶的方法。本发明还涉及用于构建能获得下一代测序(NGS)甲基化序列文库的双链共有序列的方法，这些甲基化序列文库用于全基因组测序、靶向再测序、基于测序的筛选测定法、宏基因组学或需要样品制备以进行NGS的任何其他应用。

背景技术

DNA甲基化是一种表观遗传修饰，其与基因表达和染色质结构调节直接相关。表观遗传修饰，例如DNA甲基化在哺乳动物发育例如胚胎发育中发挥作用，并且涉及染色质结构和染色质稳定性。异常DNA甲基化与包括癌症的许多疾病病程相关。另外，差异甲基化区域的特定模式和/或等位基因特异性甲基化可以用作非侵入性诊断的分子标记。重要的是，以甲基化为重点的全基因组深度测序揭示了癌症甲基化组的丰富复杂性，包括半甲基化或仅在DNA双链的一条链上甲基化。对整个基因组或循环无细胞DNA的DNA甲基化状态进行分析可能很有意义。

分析DNA甲基化的方法依赖于亚硫酸氢盐转化测序。亚硫酸氢盐处理将未甲基化胞嘧啶残基转化为尿嘧啶。当通过桑格测序(Sanger sequencing)或当前的NGS方法进行测序时，尿嘧啶残基就会被视为胸腺嘧啶。另一方面，甲基胞嘧啶被保护而不会被亚硫酸氢盐处理转化为尿嘧啶。当通过桑格测序或当前的NGS方法进行测序时，甲基胞嘧啶就会被视为胞嘧啶。在亚硫酸氢盐转化或酶促转化之后，可以通过将序列与未修饰的参考序列比较来推断单个胞嘧啶残基的转化状态。

然而，当前方法经常在文库制备和/或测序期间引入扩增或测序人为影响。这些错误会对DNA甲基化分析的结果产生不利影响。另外，当前方法未向使用者提供在数据分析期间使用独特分子标识符(UMI)的能力，并且不能区分半甲基化、完全甲基化和未甲基化事件。当前方法依赖于在连接接头之前将未甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶。因为转化发生在接头添加之前，所以不可能区分半甲基化事件。当前方法不能提供全基因组甲基化分析和靶向测序甲基化分析两者。因此，本领域需要为甲基化对基因表达至关重要的区域提供全面靶捕获系统的方法。另外，本领域需要可以以单碱基分辨率准确检测甲基化状态以及可以检测完全甲基化和半甲基化DNA的方法和组合物。

发明内容

本文公开了用于制备供甲基化分析的双索引核酸文库的方法和组合物。此外，本文公开的方法和组合物可以依赖于未甲基化胞嘧啶的亚硫酸氢盐或酶促转化。在各种实施方案中，公开的方法和组合物在亚硫酸氢盐处理或酶促转化靶序列中存在的未甲基化胞嘧啶之前使用两步标记工艺用UMI标记靶核酸。标记工艺可以将单个UMI添加到一条链或将UMI添加到靶核酸的每条链。在标记方法之后，对靶核酸进行亚硫酸氢盐处理或酶促处理以将未甲基化胞嘧啶转化为尿嘧啶。UMI用于鉴定单个DNA分子并减少扩增或测序引入的人为影响，从而提高DNA甲基化分析的准确性。另外，在亚硫酸氢盐处理或酶促转化之前用UMI单独标记每条链能够纠正错误，以便直接比较半甲基化、完全甲基化和未甲基化事件。