[发明专利]使用核酸酶靶向的IDLV的精确整合

说明书

本发明涉及包含核酸的整合缺陷型慢病毒载体(IDLV)，所述核酸在5'LTR序列和3'LTR序列之间包含至少一个核输出信号序列；至少一个目标核酸序列；以及至少一个核酸酶位点。本发明还涉及包含所述IDLV的分离细胞，包含所述IDLV或所述分离细胞的药物组合物，以及它们在治疗选自免疫性疾病、病毒性感染、肿瘤或血液病的疾病；和/或由有此需要的个体中因缺乏蛋白质或存在异常的非功能性蛋白质而引起的疾病中的药物用途。

技术领域

本发明涉及基因组工程和DNA修复领域。

特别地，本发明涉及能够在细胞基因组中进行精确且无毒的序列整合的IDLV，其具有通过高效敲入(KI)实现的高效率。

背景技术

对抗由功能缺失突变引起的有害细胞表型的主要治疗方法之一依赖于野生型基因拷贝的细胞内递送。对此，病毒介导的基因替代疗法作为一个快速发展的领域，已经提供了一些受限于对转基因拷贝数和表达水平的不完全控制的解决方案；此外，慢病毒和逆转录病毒载体的半随机整合可导致原癌基因的插入诱变和活化，而腺相关载体(AAV)和腺病毒载体将DNA作为附加体递送，其在循环细胞中被稀释。

近年来，已经开发出一种使用具有位点特异性核酸酶的基因组DNA切割来使转基因整合入选定基因座。一种途径涉及将转基因整合到其同源基因座中，例如将野生型转基因插入到内源基因座上以纠正突变基因。或者，可以将转基因插入专门选择的具有益特性(诸如永久、安全和非常高效的转基因表达)的非同源基因座。

尽管令人感兴趣，但实现转基因的高效且无毒的递送以及高效的特异性位点整合仍然是待解决的复杂问题。

使用工程化核酸酶的靶向基因组编辑正在革命性地改变基础生物医学研究，并为基因治疗带来巨大的潜力。但是，尽管进展迅速，但由于缺乏有效的工具，所追求的用于临床目的的靶向转基因整合(敲入，KI)的目标仍未实现。虽然已经成功描述了分裂和非分裂细胞中的KI，但是转基因递送的主要手段是质粒DNA，其在原代细胞(尤其是造血干细胞，HSC)中是有毒的，因此不能靶向特定细胞，且对于体内递送也是不可行的。

病毒载体DNA递送代表质粒DNA的目标替代物，特别是AAV和整合缺陷型慢病毒载体(IDLV)。慢病毒是+单链RNA(～9.7Kb)，并且一旦进入细胞核，就被逆转录以生成双链DNA，其被半随机地整合到宿主细胞基因组中。IDLV通过灭活整合酶蛋白而衍生自慢病毒，从而阻断它们整合到基因组中的能力。IDLV基因组在缺失前以不同的分子形式持续存在于细胞核中。遗憾的是，IDLV代表同源(HDR)和非同源末端连接(NHEJ)的低效DNA底物。

AAV是单链DNA病毒(～4.7kb)，并且一旦进入靶细胞的细胞核，就变成双链且成环形以作为附加体持续存在。AAV是HDR介导的KI的良好底物；但是，HDR受其在大多数原代细胞中的低效率的限制，并且主要发生在细胞周期的S/G2期，使得其在非分裂细胞中是低效的。此外，对于HDR，需要用与基因组DNA切割位点同源的基因组片段侧接转基因(每个～800bp)，这限制了可以通过AAV递送的转基因的大小(约4.7kb的装载容量)，并且可以影响AAV生产和转导(例如在二级结构的情况下)。因此，大约6％的所有人蛋白(其具有超过4kb的编码序列)与AAV和表达元件(诸如启动子和聚腺苷酸化信号(polyA信号))不适配，需要减小尺寸，通常限制了它们的转录强度和组织特异性(Chamberlain,Riyad and Weber,Hum.Gene Ther.Methods.2016 Feb；27(1):1-12)。最近，不依赖同源性的KI策略被描述为在大脑和肌肉中体内进行AAV的基于NHEJ的KI；但是，报道的效率非常低，在大多数情况下小于5％，并且整合的DNA片段的大小非常小，小于700bp(Suzuki et al.,Nature.2016 Dec1；540(7631):144-149)。