[发明专利]用于DNA和RNA修饰和功能基序的富集和检测的方法和试剂盒

说明书

本文提供了用于对核酸中经修饰的核苷酸残基进行作图的方法。该方法包括提供核酸样品，其中非靶修饰或靶修饰的和未修饰的核苷酸残基被转化为不同核苷酸的形式(诸如“C”被转化为“T”)。然后使用一组锚定碱基引物对转化的核酸进行第二链合成。一组锚定碱基引物中的每个引物在3’末端包含一个或更多个与靶核苷酸(例如，“G”或“CpG”)互补的锚定碱基，以及选自序列组的核苷酸序列，该序列组可以是完全或部分简并的序列组。例如，序列可以是5’‑XnG‑3’和/或5’‑X(n‑1)CG‑3’，其中X是任何碱基，且n＝2至25。双链核酸产物可以例如通过扩增和高通量测序来分析。

相关申请的引用

本申请要求2019年12月23日提交的美国临时申请62/953,080的优先权日的权益，其内容通过引用以其整体并入本文。

背景

表观遗传学是指细胞和生物体之间不是由遗传差异造成的表型差异。DNA中的甲基化模式会导致表型的表观遗传差异，导致例如基因表达模式的变化。DNA的甲基化通常发生在胞嘧啶残基。这包括例如5位碳的甲基化。这种甲基化的形式包括5-甲基胞嘧啶(“5mC”)和5-羟甲基胞嘧啶(“5hmC”)。5-甲基胞嘧啶的更多氧化形式包括5-甲酰基胞嘧啶(“5fC”)和5-羧基胞嘧啶(“5caC”)。胞嘧啶的甲基化通常发生在CpG位点—此处核苷酸序列是“CG”。CpG位点往往以簇的形式出现，被称为“CpG岛”。在人类中，约70％的遗传启动子包含CpG岛。启动子CpG岛中多个甲基化CpG位点的存在导致基因的稳定沉默。已知甲基化与癌症和衰老有关。在癌症中，基因沉默可能是由于启动子岛的高度甲基化。

DNA甲基化模式的作图已经成为重要的研究领域。当前正在使用若干种作图。这些方法中一个共同的入口是将DNA分子中各种形式的胞嘧啶转化为尿嘧啶，对转化的分子进行测序，并通过例如作图技术将所得序列与未转化分子的序列或基因组数据库中的序列进行比较。

对甲基化模式进行作图的最常见的方法中的一种是亚硫酸氢盐测序。用亚硫酸氢盐处理DNA将胞嘧啶残基，而不是5-甲基胞嘧啶残基或5-羟甲基胞嘧啶残基转化为尿嘧啶。因为这涉及将4-氨基基团转化为4-羰基基团，该过程也被称为脱氨基化。在第二链合成中，G与引入的U配对，并在扩增期间作为“TA”而不是“CG”增长。作图时，序列中“C”的存在表示原始的未修饰的5-甲基胞嘧啶或5-羟甲基胞嘧啶。“T”的存在表示原始的“C”(或5-甲酰基胞嘧啶或5-羧基胞嘧啶)。

该策略的变化形式包括使用十-十一易位甲基胞嘧啶双加氧酶(“TET”)和/或APOBEC3A(“A3A”)。TET将5mC、5hmC和5fC转化为5caC。亚硫酸氢盐可以将5caC转化为尿嘧啶。当与例如通过葡糖基化保护5hmC基团的方法配对时，A3A将C和5mC转化为尿嘧啶，但不转化5hmC。葡糖基化可以通过例如T4β-葡糖基转移酶来进行。可以单独设计用于对5mC或5hmC进行作图的策略。

通过多种脱氨基化策略处理的DNA可以被测序以对DNA中的甲基化位点进行作图。一种这样的方法是全基因组测序。然而，在可以定位基因组中的甲基化模式的意义上，全基因组测序可能是低效的。用于富集DNA中包含修饰(诸如甲基化)的DNA的方法是已知的。

现有的表观遗传学技术包括许多用于富集、测序和/或检测某些核酸修饰(例如甲基化)的方法，诸如：

1.基于富集的方法(MeDIP和MBD-Seq/MIRA-Seq/MethylCap-seq)，其利用修饰特异性抗体或能够特异性识别甲基化CpG的蛋白/蛋白结构域。

2.全基因组亚硫酸氢盐测序

3.简化代表性亚硫酸氢盐测序(Reduced representationbisulfitesequencing)

4.甲基化特异性(q)PCR

5.亚硫酸氢盐-PCR