[发明专利]胰高血糖素制造方法

说明书

本发明提供了一种用于制备胰高血糖素的改进方法，所述改进方法包含使N端四聚体片段与包含至少一种伪脯氨酸的C端肽偶合。所述方法在避免聚集和以高产量和纯度获得期望产物方面非常有效。

技术领域

本发明提供了用于制备高纯度胰高血糖素和相关中间物的改进方法。

背景技术

胰高血糖素为由郎格罕氏胰岛(pancreatic islet of Langerhans)的α细胞分泌的多肽激素。胰高血糖素为由29个天然氨基酸(SEQ ID NO：1，胰高血糖素1-29)组成的单链肽，并且由以下所示之化学结构表示：

1923年，化学家Kimball和Murlin首次在胰腺提取物中发现了胰高血糖素。胰高血糖素表示在被胰岛素治疗的患者或糖尿病患者的管控中可出现的严重低血糖反应治疗。

最早的胰高血糖素分离是从胰腺提取物中进行。从胰腺中进行提取是困难的，并且产物很大程度上被胰岛素污染。以上方法产量低，因此需要大量胰腺。此外，动物源性胰高血糖素可能会诱发某些患者的过敏反应，从而使其不适用于所述情况。

目前，胰高血糖素是通过重组DNA技术或通过使用固相肽合成(SPPS)产生的。几项例如US4826763或US6110703的专利描述使用重组DNA技术或遗传修饰的酵母细胞进行的胰高血糖素合成。

重组技术除了极其昂贵之外，也是一种工业上复杂的方法。其需要使用专门的设备、合成期间的改良生物体以及精心制作的分析和纯化程序。除了成本高外，生产生物分子的生物技术方法还存在可重复性低的问题。

胰高血糖素的固相肽合成方法相对困难，这是因为长肽链因由于分子间和分子内氢键而经常出现树脂上聚集现象，从而产生几个作为杂质出现的截短序列，降低了最终化合物的产量和纯度。

美国专利US3642763描述了通过在N-羟基-琥珀酰亚胺或N-羟基邻苯二甲酰亚胺存在的情况下缩合[aa 1-6]和[aa 7-29]肽片段并且随后在三氟乙酸存在的情况下分离保护基团进行的胰高血糖素合成。所述专利没有公开在所述方法中获得的化合物的纯度。

中国专利CN103333239描述了胰高血糖素固相肽合成方法，其中，氨基酸缩合是在较高温度下进行，并且其中，公开了使用伪脯氨酸二肽作为4/5位和7/8位处的保护基团。然而，通过所述方法获得的胰高血糖素的纯度始终较低。

因此，需要用于合成胰高血糖素的改进方法，所述方法以高产量和纯度提供产物，并且还具有成本效益和工业可行性。

发明目的

本发明的一个目的在于克服现有技术的上述缺点。

本发明的另一个目的在于提供用于制备胰高血糖素的改进方法，所述方法以高产量以及高纯度提供产物。

本发明的另一个目的在于提供用于合成胰高血糖素的有用中间物。

发明内容

本发明提供了用于制备胰高血糖素的改进方法。

在一个实施例中，本发明涉及用于制备胰高血糖素的方法，所述方法包含使N端四肽(1-4)(SEQ ID NO：2)与C端肽(5-29)(SEQ ID NO：3)偶合，其中，C端肽包含至少一种伪脯氨酸二肽。

N端四肽(1-4)的序列为His(P)-Ser(P)-Gln(P)-Gly-OH，其中，P为侧链保护基团或不存在。