[发明专利]用于肌肉表达的杂合启动子

说明书

本发明涉及在肌肉中驱动基因表达的杂合启动子。

技术领域

本发明涉及在肌肉中驱动基因表达的杂合启动子。本发明还涉及含有所述杂合启动子的表达盒和载体。本文还公开了使用这些杂合启动子的方法，特别是基因治疗的方法。

背景技术

神经肌肉障碍代表了基于体内的基因疗法的主要挑战之一。对于许多疾病来说，在所需靶组织中转入基因的表达不足和抗转入基因免疫力仍然是实现成功基因疗法的重要障碍。因此，对于在感兴趣的细胞中提供转入基因的强表达，但使用低剂量的载体以防止所述载体的潜在毒性和针对所述载体的免疫应答两者，仍存在着需求。

理论上，这个目标可以通过选择在靶细胞中提供强表达的启动子来解决。然而，它们的使用可能产生几个问题。具体来说，在设计用于基因疗法的构建物时，人们必须牢记用于递送治疗性转入基因的载体特有的尺寸限制。例如，由于AAV载体的最大包封尺寸即大约5kb所带来的限制，引入到AAV载体中的元件应该具有减小的尺寸。

在这里，我们描述了具有与基因疗法载体例如AAV载体相容的尺寸的增强子/启动子组合的鉴定，所述组合允许在肌肉中高效表达蛋白质。

发明内容

本发明提供了产生具有肌肉特异性的新型杂合启动子的遗传工程策略。这些杂合启动子可用于神经肌肉疾病的基因疗法中。这些新型杂合启动子是基于可操作连接到肌肉选择性启动子的一个或多个肝选择性增强子的组合。令人吃惊的是，在本文中显示，当置于这种包括肝选择性增强子的杂合启动子的控制之下时，转入基因在肌肉细胞中的表达被提高。

因此，本发明的第一方面涉及一种核酸分子，其包含可操作连接到肌肉选择性启动子的一个或多个肝选择性增强子。

在另一个特定实施方式中，所述核酸分子包含可操作连接到肌肉选择性启动子的一个肝选择性增强子。在另一个实施方式中，所述核酸分子包含可操作连接到肌肉选择性启动子的多个肝选择性增强子。在特定实施方式中，所述多个肝选择性增强子包括至少两个肝选择性增强子。在又一个实施方式中，所述多个肝选择性增强子包括两个肝选择性增强子。在另一个实施方式中，所述多个肝选择性增强子包括三个肝选择性增强子。在另一个实施方式中，所述多个肝选择性增强子包括四个肝选择性增强子。在又一个实施方式中，所述多个肝选择性增强子包括五个肝选择性增强子。在特定实施方式中，所述核酸分子包含一个、两个或三个肝选择性增强子，更特别地一个或三个肝选择性增强子。在特定实施方式中，所述多个肝选择性增强子中的所有肝选择性增强子具有相同的序列，或所述多个肝选择性增强子中的至少两个肝选择性增强子具有不同的序列。在特定实施方式中，所述多个肝选择性增强子中的所有肝选择性增强子具有相同的序列。

在本发明的核酸的特定实施方式中，所述增强子可以是短尺寸肝选择性增强子，或者所述多个肝选择性增强子可以是多个短尺寸肝选择性增强子。具体来说，在本发明中使用的肝选择性增强子可以由10至175个核苷酸，例如40至100个核苷酸，特别是50至80个核苷酸构成。在特定实施方式中，在本发明中使用的肝选择性增强子可以由70至75个核苷酸构成。在特定实施方式中，所述肝选择性增强子是由SEQ ID NO：1构成的72个核苷酸的HS-CRM8增强子或具有肝选择性增强子活性的SEQ ID NO：1的功能性片段。在另一个实施方式中，所述肝选择性增强子是所述72个核苷酸的HS-CRM8增强子的功能性变体，所述功能变体与SEQ ID NO：1具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO：1具有至少85％同一性，特别是具有至少90％同一性，更特别地具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性，其中所述功能性变体具有肝选择性增强子活性。在另一个实施方式中，所述肝选择性增强子是由与SEQ ID NO：1具有至少80％同一性，例如与SEQ ID NO：1具有至少85％同一性，特别是具有至少90％同一性，更特别是具有至少91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或甚至至少99％同一性的序列构成的序列的功能性片段，其中所述功能性片段具有肝选择性增强子活性。