[发明专利]用于高效生成瑞鲍迪苷的ABC转运蛋白

说明书

本发明提供了用于改进甜菊糖苷生成量的经遗传修饰的宿主细胞、组合物和方法。在一些实施方案，所述宿主细胞经遗传修饰以包含异源核酸表达盒，所述异源核酸表达盒表达能够将甜菊糖苷转运至细胞外空间或转运至细胞内细胞器的腔空间的ABC转运蛋白。在一些实施方案，所述宿主细胞进一步包含一种或多种异源核苷酸序列，所述一种或多种异源核苷酸序列编码能够在所述宿主细胞中生成一种或多种甜菊糖苷的途径的其他酶。本发明所述的宿主细胞、组合物和方法提供了异源生成甜菊糖苷(包括但不限于，瑞鲍迪苷D和瑞鲍迪苷M)的有效途径。

1.相关申请的交叉引用

本申请要求并享有于2019年1月24日提交的、发明名称为“ABC TRANSPORTERS FORTHE HIGH EFFICIENCY PRODUCTION OF REBAUDIOSIDES”的美国临时专利申请序列号62/796,228的优先权，此临时申请的内容在此通过引用完全并入本申请。

2.发明领域

本发明涉及特定的ABC转运蛋白(ABC-transporter)、包含所述ABC转运蛋白的宿主细胞，以及其用于生成甜菊醇和/或瑞鲍迪苷(包括瑞鲍迪苷D和瑞鲍迪苷M)的方法。

3.发明背景

需要源自天然来源的低热量甜味剂来限制高糖消耗对健康的影响。甜叶菊植物(Stevia rebaudiana Bertoni)产生多种甜味的糖基化二萜，称为甜菊糖苷(steviolglycoside)。在所有已知的甜菊糖苷中，Reb M的效力最高(比蔗糖甜约200-300倍)，并具有最吸引人的风味特征。然而，Reb M仅由甜叶菊植物少量生成，并且仅占甜菊糖苷总含量的一小部分(1.0％)，因此从甜菊叶中分离Reb M是不切实际的。需要其他获得Reb M的方法。其中一种方法是应用合成生物学来设计微生物(例如，酵母)，其可从可持续原料来源生成大量Reb M。

为了使用合成生物技术经济地生成产品，从原料到产品的生物转化中的每个步骤均需具有高转化效率(理想情况下90％)。在我们对酵母进行工程改造以生成RebM时，我们注意到Reb M的细胞溶质积聚抑制了工程化到酵母中的甜菊糖苷代谢途径，从而限制了发酵运行的总产量。此种抑制可能是由于参与甜菊糖苷生物合成的一种或多种酶的产物抑制或终产物抑制所致。因此，需要减轻产物抑制的新机制，以提高生物合成Reb M生成量的转化效率。

4.发明摘要

本发明提供了用于改进Reb M的生成量的经遗传修饰的宿主细胞、组合物和方法。所述这些组合物和方法部分基于某些异源ABC转运蛋白在宿主细胞中的表达，所述宿主细胞经遗传修饰以生成甜菊糖苷类化合物，例如Reb M。所述这些ABC转运蛋白能够将某些甜菊糖苷，优选Reb M和/或相关的高分子量甜菊糖苷瑞鲍迪苷D(Reb D)，从胞质溶胶转运至细胞外空间或转运至亚细胞器的腔内，例如酵母液泡。某些甜菊糖苷(如Reb D和Reb M)的螯合可通过减轻由甜菊糖苷积聚引起的产物抑制来提高甜菊糖苷代谢途径的效率。

在本发明的一个方面，本发明提供了经遗传修饰的宿主细胞及其用于生成工业上有用的化合物的方法。一方面，本发明提供了能够生成一种或多种甜菊糖苷(steviolglycoside)的经遗传修饰的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含编码ABC转运蛋白的异源核酸，所述ABC转运蛋白具有与选自由下列组成的组的氨基酸序列具有至少80％序列同一性的氨基酸序列：SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：5、SEQID NO：6、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8、SEQ ID NO：28、SEQ ID NO：29、和SEQ ID NO：30。